唾液富组蛋白5作用后白念珠菌超微结构的改变

                           作者：高琪, 张金廷, 陈惠珍, 李庆星

【摘要】  目的：电镜观察HRPs5作用后白念珠菌超微结构的变化。方法：将一定数量的孢子与一定浓度的HRPs5混合培养后，在扫描电镜下分析对照组与试验组菌细胞的变形率有无显著性差异；并且扫描电镜和透射电镜下观察HRPs5作用后白念珠菌超微结构的变化。结果：扫描电镜观察经过HRPs5处理过白念珠菌孢子表面不光滑并有明显的凹陷和穿孔。5000倍扫描电镜下分析对照组与实验组菌细胞的变形率有极显著性差异（P＜0.001）。透射电镜观察经过HRPs5处理过的白念珠菌孢子可见细胞质内有空泡变性等改变。结论：富组蛋白能破坏白念珠菌的细胞膜，诱导胞内物质丧失，从而导致生物体死亡。

【关键词】  唾液； 富组蛋白5； 白念珠菌； 抗菌活性

　　Study microstructure Changes of Blastoconida After infected by slaliva HRPs 5

　　Abstract: Objective: Microstructure changes of blastoconidia after infected by HRPs5 were observed with SEM and TEM. Method:Some of blastoconidia of standard candida albicans(ATCC22019) were mixed with HRPs5,and cultured by Sabouraud dextrose agar. To compare the difference of the percentage of deformation between the treatment group and control group under SEM.As the same time,microstructure changes of blastoconidia after infected by HRPs5 were observed with SEM and TEM.  Result:Blastoconidia infected by HRPs5 has rough surface with obvious hollow and perforation with SEM. There are significant different between treatment group and control group with SEM of 5000 times(P<0.001).Organell were unclear and vacuoles formed with TEM. Conclusion:Micrographs suggest that HRPs5 damage cell membrane and induce the loss of intracellular materials, which leading to the death of organism.
 
　　Key words:  Slaliva;  HRPs5;  Candida albicans;  Anticandidal activity   

　　富组蛋白(histidine rich protein,HRPs或 histatins )是一族存在于灵长类动物腮腺和颌下腺分泌物中富含组氨酸的小分子、阳离子多肽［1～3］。HRPs作为一组内源性多肽，在宿主非免疫防御系统中起重要作用，与多种口腔感染性疾病密切相关［4］。1984年Pollock2等首次报道了HRPs混合物抗口腔白念珠菌作用，本实验用扫描电镜和透射电镜观察HRPs5作用后白念珠菌超微结构的变化。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料与菌悬液的制备：

　　①标准白念珠菌（ATCC），由河北医科大学第二附属皮肤科真菌室提供。②沙氏固体培养基：1%蛋白胨、4%葡萄糖、0.025%氯霉素2%琼脂。③沙氏液体培养基：1%蛋白胨、4%葡萄糖、0.05%放线菌酮、0.025%氯霉素。④HRPs5购自Sigma公司。⑤10mM的PPB （PH7.4）：1mM磷酸氢二钾加蒸溜水至1l， 1mM磷酸二氢钾加蒸溜水至1l，分别取80.2ml和19.8ml混匀。⑥对数生长期念珠菌菌悬液的制备：标准白色念珠菌常温复苏，接种至沙氏液体培养基，在30℃恒温水浴振荡培养4～6h，1000转/min离心5min，弃上清液，PPB洗涤，用血细胞计数板计数后调整菌悬液的浓度至2×10个/ml。

　　1.2  分组与方法：

　　①实验组：实验管中加入100uμg/ml的 HRPs5和对数生长期念珠菌菌悬液（2×10个/mL）各0.1 ml(时此菌悬液的浓度为10个/ml ，HRPs5的浓度为50ug/ml)。②对照组：对照管中加入10mM的PPB和对数生长期念珠菌菌悬液（2×10个/mL）各0.1 ml，扫描电镜（S-3500N）下观察并照相。③透射电镜标本的制备：实验管中加入100ug/ml的HRPs5和对数生长期念珠菌菌悬液（2×10个/ml）各0.1 ml,对照管中加入10mM的PPB和对数生长期念珠菌菌悬液（2×10个/ml）各0.1 ml(时此菌悬液的浓度为10个/ml ，HRPs5的浓度为50ug/ml)，37℃恒温水浴3h后用离心机离心（2000转/min），弃上清，加入45℃的融化的2%琼脂，透射电镜（H-7500）下观察并照相。

　　2  结  果

　　扫描电镜观察对照组的白念珠菌芽生孢子为椭圆形，表面致密光滑，细胞膜完整，并有顶端出芽现象（见图1，2）；HRPs5作用3h后，孢子外形不规则，细胞膜不完整，表面粗糙，部分已破坏（见图3，4）。5000倍扫描电镜下分析对照组与试验组菌细胞的变形率结果（见表1），二者间经统计学处理，有极显著性差异(P<0.001)。（变形细胞：孢子外形不规则，细胞膜不完整，表面粗糙；未变形细胞：椭圆形，表面光滑，细胞膜完整）。透射电镜观察对照组菌细胞的细胞壁、细胞膜完整，细胞质较均匀，细胞核结构清晰（见图5）。而试验组细胞壁与细胞膜之间有一狭窄点子光区，细胞壁与细胞膜不光滑。可见细胞质有空泡变性（见图6）。
表1  实验组与对照组菌细胞变形率的比较（略）

　　3  讨  论   

　　由于富组蛋白的生物学功能是当今唾液蛋白质研究的重点课题之一，因此国外许多学者采用不同方法研究其抗真菌作用。1984年Pollock2等首次报道了HRPs混合物抗口腔白念珠菌作用。近几年国内外的研究进一步证实了这一结果。白念珠菌是定居在健康人类口腔中的一种正常菌群，自健康成人口腔分离培养的白念珠菌阳性率为25%～50%。白念珠菌有两种主要的存在形式：孢子和菌丝，其中菌丝为白念珠菌孢子在一定的条件下发芽而形成的，为白念珠菌的感染型，可激发粘膜产生炎症反应［5，6］。正常白念珠菌细胞的最外层为一层坚韧的细胞壁，主要功能是维持细菌外形和起保护作用。而细胞膜是生活细胞的屏障，对细胞生命活动起保护作用，同时又是细胞内外能量转换和信息传递的场所。Pollock［3］等证实HRPs能使白念珠菌芽生孢子钾离子快速从胞溢出。这与Santarpi［7］等的研究结果一致。Raj［8］等首先用圆二色性（CD）光谱法来分析HRPs5及其片段发现HRPs在口腔的极性溶液中呈无规则构象，这种构象可使HRPs与白念珠菌细胞膜受体结合，从而使蛋白质分子的构象转变为α螺旋。而大多数具有α螺旋结构的多肽一般能自发进入细胞膜［9］。Lear［10］等也发现具有α螺旋结构的多肽与乙酰胆碱受体有相似的特征，能形成稳定的离子通道。Dalbey［11］等认为正电荷残基在膜蛋白质局部起重要作用。膜蛋白质的正电荷残基可以与膜的磷脂头通过静电力结合。这样一来HRPs5的C16残基既可以通过氢键与膜结合，又可以通过氨基端和羧基端的正电荷与磷脂头静电力结合，这种膜结合蛋白就可以发挥生物学作用。本实验发现经过HRPs-5处理过的白念珠菌孢子经扫描电镜观察，其外形不规则，细胞壁不完整，表面粗糙，部分已破坏；而对照组的白念珠菌芽生孢子为椭圆形，表面致密光滑，细胞膜完整，并有顶端出芽现象。透射电镜观察经过HRPs-5处理过的白念珠菌孢子细胞壁与细胞膜之间有一狭窄点子光区，在这一阔区域和胞浆中同时出现大量的光点，其胞浆中有空泡状物。细胞膜不光滑，有褶皱形成。可见细胞质有空泡变性。这些超微结构的改变提示HRPs5能破坏白念珠菌的细胞膜，诱导细胞内物质丧失而导致细菌死亡。

【】
  　　［1］Troxler RF,Offner GD,Xu Tao,et al. Dent Res，1990，69(1):2-6.

　　［2］Oppenheim FG, Xu Tao,Mcmillian FM ,et al. Biol Chem,1988,263(16):7472-7477.

　　［3］Pollck JJ,Denepitiyal L,Mackay BJ ,et al.Infect Immun,1984,44(3):701-707.

　　［4］赵心臣，综述，乐进秋，魏国贤,审校.国外医学口腔分册,1995,22(1):24-27.

　　［5］廖万清，吴绍熙，王高松.真菌病学［M］.人民卫生出版社.

　　［6］卫生部继续委员会编.国家继续教育项目系列教材选编（第一辑）,口腔医学分册［M］.长春出版社.

　　［7］Santarpia RPⅢ,Cho M-T, Pollck JJ. Oral Microbiol Immunol,1991,5(4):226.

　　［8］Raj PA,Edgerton M,Levine MJ. Biol Chem,1990,265(7):3898.

　　［9］Milon A,Miyazawa T,Higashijima T.Biochemistry,1990,29:65.

　　［10］Lear JD,Wasserman ZR,Degrado WF.Science,1988,240:117.

　　［11］Dalbey RE.Biochem Soc Trans,1990,15:253.