血管内皮生长因子在非小细胞肺癌中的表达及意义

                         作者：朱光君，熊正文，李红伟，黄勇

【关键词】  非小细胞肺癌

    ［摘要］ 目的：探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中血管内皮生长因子(VEGF)表达与肿瘤浸润和淋巴结转移的关系。方法：应用VEGF抗体，采用微波LSAB免疫组化染色方法对78例手术切除的NSCLC进行VEGF免疫组化染色标记，并取10例正常组织对照。结果：78例NSCLC的VEGF平均为（65.8±14.3），有淋巴结转移的VEGF(2.82±1.21)表达与无淋巴结转移的VEGF(1.28±1.08)、正常对照的VEGF(1.03±1.02)比较，差异具有非常显著的统计学意义(P<0.01)。VEGF与年龄、性别、吸烟史、肿瘤大小以及病分级等临床病理学特性均无明显相关关系(P>0.05)。结论：NSCLC内VEGF表达强度与淋巴结转移密切相关，可作为预测NSCLC病人预后和发生转移的生物学指标之一。

　　［关键词］ 血管内皮生长因子；非小细胞肺癌；淋巴结转移

　　Expression of Vascular Endothelial Growth Factor in Human Nonsmall Cell Lung Carcinoma and its Significance

　　Abstract:Objective To investigate the relationship between the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and lymph node metastasis of nonsmall cell lung carcinoma (NSCLC).Methods Immunohistochemical staining technique (LSAB method) using antibodies against VEGF was carried out on archival specimens of 78 cases of human NSCLC and 10 cases normal control.Results The average counts of VEGF in 78 NSCLC were 2.01+1.03.Expression of VEGF was higher in metastatic tumors(2.82±1.21) than in nonmetastatic tumors(1.28±1.08) and normal lung tissue(1.03±1.02). VEGF was related closed to lymph node metastasis(P<0.01).No relationship exist and patients' sex,age,history of smoking, the size of tumors, and histological type, etc.Conclusion The positive expression of VEGF is correlated with metastasis of non small cell lung cancer.VEGF may be used as a hopeful marker for predicting the prognosis and metastasis of patients with non small cell lung carcinoma.

　　Key words：VEGF；Non small cell lung carcinoma；Lymph node metastasis

　　肿瘤的生长和转移是一个复杂的多步骤过程，受到多种因素的影响，近年来研究发现血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达与肿瘤浸润、转移的相关关系研究已在前列腺癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌和肝细胞癌等肿瘤的研究中得到证实［1～4］。但有关VEGF在非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer ,NSCLC)中表达研究的报道较少［5］。因此，我们应用LSAB免疫组化染色方法初步观察了78例NSCLC组织中VEGF表达及其与癌组织学类型、分化程度及转移情况的相关关系。

　　1材料与方法

　　1.1材料  收集251病理科1980年至2002年原发性NSCLC术后标本78例和10例正常肺组织作为对照，每例肺癌经两位有经验的病理医师，根据WHO 1981年的肺癌分类标准及1997年第八届国际肺癌大会制定的分期补充标准重新分类、分级［6，7］。每例挑选最大肿瘤面积的NSCLC石蜡包埋组织块，以及术中和病理大体检查中所取的淋巴结组织，常规石蜡切片4 μm，65 ℃～70 ℃烤片1 h～1.5 h。单克隆抗体即用型VEGF购于福州迈新生物制品有限公司，LSAB试剂盒为DAKO公司产品。YWY 781B型医用微波仪为浙江临安爱迪仪器厂生产。

　　1.2免疫组化染色方法  根据微波(Microwave，MW)热效应的原理，参照文献介绍的方法，采用MW抗原修复、LSAB免疫组织化学染色方法［8，9］。具体步骤如下：第一，石蜡切片常规脱蜡入水，用MW 5 档(输出功率90 W，下同)，在甲醇双氧水中封闭内源性过氧化物酶2 min，PBS洗2×2 min；第二，抗原修复［10］：FⅧ用胰蛋白酶消化。CD34、CD31用微波柠檬酸缓冲液(0.01 mol/L，pH6.0)做抗原修复，先用MW3档(输出功率150W)修复抗原2 min，再用MW 5档修复抗原2×5 min，待冷却至近室温时自来水洗，PBS洗2×2 min；第三，用0.03%Triton X100处理切片10 min，或MW5 档2 min，PBS洗2×2 min；第四，用5%正常羊血清封闭，MW 5档处理切片2 min；第五，加一抗，4 ℃冰箱过夜，从冰箱中取出后，MW 5档5 min,PBS洗3×2 min;第六，加生物素化的羊抗术鼠(1∶300)，37 ℃、30 min，然后再MW 5档5 min，PBS洗3×2 min；第七，加LSAB试剂(1∶300),37 ℃、30 min，然后再MW 5档5 min，PBS洗3×2 min；第八，DABH2O2显色10 min；自来水终止显色；第九，苏木素复染0.5 min~1 min；第十，切片常规酒精脱水、二甲苯透明、树胶封片，观察和图像分析免疫组织化学染色结果。对照染色：每次用已知VEGF阳性的乳腺癌切片作为阳性对照；用PBS代替一抗或生物素标记的二抗作为阴性对照。

　　1.3结果判定

　　1.3.1VEGF判断标准［8］ 按照Volm等的评判标准：A选择染色均匀的肿瘤间质区在400倍视野下，以着色细胞占视野细胞总数的多少分为0～3级。0级：无着色细胞；1级：＜25%；2级26%～50%；3级：＞50%。B按着色细胞强弱分：0级：阴性；1级：弱阳性；2级：中度阳性；3级强阳性。按A+B值判定结果，以0～3+表示。0：0；+：1～2；2+：3～4；3+：5～6。

　　1.3.2统计分析  所有数据以均数±标准差(±s)表示，进行方差分析和t检验，P<0.05为差异有显著性。

　　2结果

　　2.1病理特征  78例NSCLC例病人中，男52例(66.7%)，女26例(33.3%)，平均年龄55.6岁(中位数54岁，范围34岁~80岁);吸烟者53例(67.9%)，非吸烟者25例(32.1%)。鳞癌38例(48.7%)，腺癌27例(34.6%)，大细胞癌6例(7.7%)，腺鳞癌7例(9.0%)。有淋巴结转移27例(34.6%)，无淋巴结转移51例(65.4%)。Ⅰ期50例(64.1%)，Ⅱ期17例(21.8%)，Ⅲa期11例(14.1%)，Ⅰ、Ⅱ期共计67例(85.9%)。高分化19例(24.4%)，中分化33例(42.3%)，低分化21例(26.9%)，未分化5例(6.4%)。

　　2.2VEGF在NSCLC中的表达  VEGF阳性反应物为浅棕至深棕色颗粒，广泛分布在多种细胞，如巨噬细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞和肿瘤细胞等，但以肿瘤细胞和内皮细胞为主。VEGF在10例正常组织的表达为1.03±1.02，78例NSCLC的VEGF平均为（65.8±14.3）无淋巴结转移肺癌组织中VEGF表达与正常对照肺组织比较，差异无显著性(t=0.67，P>0.05)；有淋巴结转移组肺癌组织中的VEGF(2.82±1.21)表达与无转移组和正常对照组比较，差异均有非常显著性(t=5.75，4.04，P<0.01)。VEGF与年龄、性别、吸烟史、肿瘤大小以及病分级等临床病理学特性均无明显关系(P>0.05)。VEGF在NSCLC中的表达详见表1。

　　表1  VEGF与NSCLC病人临床病理特征的关系(略)

　　注：★与无转移组比，t=5.75,P<0.01。

　　3讨论

　　过去常常用传统的病理学方法来评价肿瘤的预后(即同时考虑病理变化如肿瘤大小、组织学分类、肿瘤分化程度、血管及淋巴管浸润、肿瘤分期等)，肿瘤分期具有显著的预后意义，一直被临床用来估计病人的预后。由于NSCLC具有明显的异质性(同一期组织学相似的NSCLC可能有不同的临床后果)，仅靠肿瘤分期已不能准确判断预后。近年来，随着肿瘤生物学和分子遗传学的，出现了许多很有潜力的显示预后的因素，如cerbB2原癌基因、p53抑癌基因、p21基因、Rb蛋白、Ki67抗原、PCNA等，这些生物学标志物在肺癌中的研究均有不同程度的报道，并取得了较好的结果，对术后肺癌这一高危病人的认识以及指导临床都产生了重要的意义［10,11］。

　　除了内皮细胞标记物评价肿瘤形成新生血管的能力和肿瘤的预后外，还有许多新生血管因子，如VEGF、碱性成纤维生长因子(bFGF)、纤维母细胞生长因子（FGF），转化生长因子（TGFS）和血小板源性生长因子（PDGF）等［10,12，13］。其中VEGF是近年来发现的一个新的血管调节因子［2～4］，它是一种糖基化分泌性多肽因子，人VEGF基因定位于染色体6p21.3，分子量约4.3KD，VEGF基因经过转录水平的剪切，可产生5种不同的转录子：分别含有121、165、189、206和145个氨基酸。其中VEGF121和VEGF165以可容蛋白形式存在，容易到达靶细胞；VEGF189和VEGF206保留在细胞基质中，很多组织以VEGF165表达为主。VEGF能使血管通透性明显增加，以旁分泌方式特异地促进血管内皮细胞分裂增殖，而改变内皮细胞基质的活化形式，透导内皮细胞表达蛋白的水解酶、间质胶原酶和组织因子，这些作用共同促使血浆纤维蛋白外渗，导致纤维素在肿瘤间质中沉积，促进巨噬细胞、纤维母细胞及内皮细胞生长，从而在原位诱导血管生成。因此VEGF与血管内皮细胞增殖过程中的病理生理密切相关并占重要地位，尤其是与抗乳腺癌、胃癌和肝细胞癌等实体瘤的生长和转移关系更加密切［2～4］。MVD与复发浸润转移相关，而VEGF又与MVD密切相关，所以VEGF也与肿瘤的浸润转移密切相关。

　　正常组织中VEGF表达很低，而在病理状态尤其是肿瘤组织中，VEGF表达明显升高。我们应用VEGF抗体对78例非小细胞肺癌和10例正常肺组织切片进行免疫组化标记发现VEGF虽然在多种细胞表达，但以肿瘤细胞和内皮细胞为主，其结果提示在非小细胞肺癌中，VEGF的合成和分泌主要在肿瘤细胞和内皮细胞，而且以自分泌和旁分泌方式作用于肺癌细胞和内皮细胞。VEGF在正常肺组织和肿瘤组织中均有表达，但表达程度并不一样，有淋巴结转移组与无转移组、正常组之间差异均存在显著性(P<0.01)，而且与年龄、性别、吸烟史、肿瘤大小以及病理学分级等临床病理学特性均无明显关系(P>0.05)。VEGF的表达程度是判定非小细胞肺癌转移和预后的一个重要指标［14］。

　　：

　　［1］Keledjian K,Borkowski A,Kim G,et al.Reduction of human prostate tumor vascularity by the alphaladrenoceptor antagonist terazosin［Ｊ］.Prostate,2001,48(2):7178.

　　［2］Jacobs TW,Schnitt SJ,Tan X,et al.Radial scars of the breast carcinomas have similar alterations in exprssion of factors involved in vascular stroma formation［Ｊ］.HumPatol,2002,33(1):2938.

　　［3］Yonemura Y,Endo Y,Fujita H,et al.Role of vascular endothelial growth factor C expression in the development of lymph node metastasis in gastric cancer［Ｊ］.Clin Cancer Res,1999,5:18231829.

　　［4］Ng IO,Poon RT,Lee JM,et al.Microvessel density, vascular endothelial growth factor and its receptors Flt1 and flk1/KDR in hepatocelluar carcinoma［Ｊ］．Am J Clin Pathol,2001，116(6):838845.

　　［5］Vlom M,Koomagi Q,Mattren J.Prognostic value of vascular endothelial growth factor and its recptot Flt1 in squamous cell lung cancer.Int. J Cancer,1997,74(1):6469.

　　［6］ountain CF.Revisions in the international system for staging lung cancer［Ｊ］.Chest, 1997，111(5):710717.

　　［7］Mountain CF, Dresler CM. Regional lymph node classification for lung cancer stging［Ｊ］.Chest, 1997,111(5):718721.

　　［8］熊正文.免疫组织化学技术中抗原修的研究进展［J］．中华病理学杂志,1997，26(2):124126.

　　［9］熊正文，朱光君，苏红，等.CD34与FⅧ显示非小细胞肺癌微血管密度的对比研究［J］.中华临床医药,2001，13(15):23222325.

　　［10］熊正文，朱光君，李春光.肿瘤血管及非小细胞肺癌检测技术研究进展［J］.中华医学杂志,2001，1(3):1215.

　　［11］周清华，汪蕙.21世纪我国肺癌基础研究的重点与方向［J］.肺癌杂志，2000，3(1):57.

　　［12］Kohlberger PD,Obermair A,Sliutz G,et al.Quantitative immunohistry of factor Ⅷrelated antigen in breast carcinoma:a comparison of computerassisted image analysis with established counting methods see comments［Ｊ］. Am J Clin Pathol,1996，105(6):705710.

　　［13］Macchiarini P,Fontanini G,Dulmet E,et al.Relation of neovasculature to metastasis of nonsmall cell lung cancer［Ｊ］．Lancet,1992，340(8812):145146.

　　［14］Ushijima C,Tsukamoto S,Yamazaki K,et al.High vascularity in the peripheral region of nonsmall lung cancer tissue is associated with tumor progression,2001，34(2):233241.