HPLC法测定丹参超临界萃取物中丹参酮ⅡA的含量

【关键词】  ,高效液相色谱法

    ［摘  要］ 目的：建立超临界流体萃取(supercritical fluid extraction，简称SFE)技术和高效液相色谱(HPLC)技术联用测定丹参中主要成分丹参酮ⅡA含量的方法。方法：探讨改性剂、温度、压力等条件对回收率的影响，确定SFECＯ2萃取丹参中丹参酮ⅡA的最佳条件；并采用HPLC法对萃取成分中丹参酮ⅡA进行定量分析，确定最佳的色谱分析条件。结果：用超临界流体萃取丹参的最佳萃取条件为：萃取压力30 MPa，萃取温度45 ℃；分离釜I压力16 MPa，温度40 ℃；分离釜Ⅱ压力8 MPa，温度33 ℃；CO2流量为3．3 L/h：萃取时间6 h；改性剂用丙酮，流速为0．3 L/h。最佳色谱条件：ODSC18色谱柱(4．6 mm×250 mm)，流动相为甲醇水(V∶V=75∶25)，紫外检测波长270 nm，流速1．0 ml/min。丹参酮ⅡA浓度在23．36 μg/ml～116．80 μg/ml范围内，峰面积与进样量线性关系良好，平均回收率为99．12％，RSD=1．99％。结论：用SFE HPLC联用提取测定丹参中主要成分丹参酮ⅡA回收率高、方法快速简便、结果准确、灵敏度高、重现性好。

　　［关键词］ 高效液相色谱法；超临界流体萃取；丹参；丹参酮ⅡA

　　丹参是我国传统使用的中药，具有祛瘀止痛、活血通经、清新除烦之功效，能抑制血小板黏附、聚集和释放，扩张血管和改善微循环，近年来还证实具有抗氧化和钙拮抗作用［1］。药理研究表明，丹参主要有效成分包括丹参素、丹参酮、原儿茶醛。其主要化学成分之一丹参酮ⅡA有明显的抗炎作用，并广泛应用于冠心病的［2］，近年来还被应用于肿瘤的治疗［3］。《中华人民共和国药典》(2000年版)以丹参酮ⅡA作为标定丹参的主要成分［4］。超临界CO2流体萃取(简称SFECO2萃取)技术是近20年来起来的在分离领域出现的一种新技术［5］。它与常规溶剂萃取的区别是选用一种称为超临界流体(SF)的物质代替有机溶剂作为萃取剂。它是利用在临界点附近，体系温度和压力的微小变化可导致物质溶解度发生几个数量级的突变的特性实现物质的分离。该法具有无毒、快速、廉价、低温操作等优点。本实验采用HPLC法对丹参超临界萃取物中丹参酮ⅡA的含量进行定量测定。

　　1  材料与方法

　　1．1  实验仪器  SFE-1型超临界萃取器(大连八达空间应用技术研究所)，本系统由萃取釜、分离釜Ⅰ、分离釜Ⅱ、制冷机、高压泵和净化器6部分组成。
日本岛津LC-10AD型高效液相色谱仪，77251进样阀(Rheodyne USA，附20 μl定量环管)，SPD-10A紫外可变波长检测器(JAPAN)，ODS-C18色谱柱(4．6 mm×250 mm)；江申色谱工作站；V-560紫外分光光度计(JASCO日本分光株式会社)；TG328A型分析天平(上海天平仪器厂)，SK-1快速混匀器；CQ250超声波清洗器(上海超声波仪器厂)，真空泵(天津)、针筒式油膜过滤器(0．45 μm)(大连伊利特科学仪器有限公司)。

　　1．2  药材与试剂  丹参(安徽毫州，批号021112)；丹参酮ⅡA标准品(药品生物制品鉴定所)；CO2(大连化学物理研究所)；甲醇为色谱纯(天津市科密欧化学试剂开发中心)；丙酮为分析纯；水为去离子水。

　　1．3  超临界流体萃取过程  将丹参的根茎切粒后投入萃取釜中，按设定的萃取路线：CO2钢瓶―冷冻系统―高压泵―萃取釜―分离釜I―分离釜Ⅱ―净化器―CO2贮罐(循环用)。分别对萃取釜、分离釜I、分离釜Ⅱ进行加热，当温度分别达到45℃、40℃、33℃ 时，通过高压泵对萃取釜、两个分离釜进行加压，当压力分别达到30 MPa、16 MPa、8 MPa时，开始循环萃取，并保持恒温恒压，CO2流速3．3 L/h。萃取分离时每隔一定时间放出萃取产物。图1：SFECO2流程示意图（略）

　　1．4  色谱条件  ODSC18柱(4．6 mm×250 mm)，流动相为甲醇∶水(V∶V=75∶25)，紫外检测波长270 nm，流速1．0 ml/min，温度为室温，进样量为20 μl。

　　1．5  标准溶液的配制  丹参酮ⅡA标准品至干燥器中干燥24 h，精密称取14．64 mg，置25 ml棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再配制成每毫升含23．36 μg，46．72 μg，70．08 μg，93．44 μg，116．80 μg，140．16 μg的标准品甲醇溶液，放入冰箱冷藏室保存。

　　1．6  标准曲线的制备  在上述色谱条件下进样测定，记录丹参酮ⅡA的色谱图，见图1（略）。每个实验点重复进样3次，分别记录峰面积，峰面积平均值(Y)，结果见表1。以丹参酮ⅡA标准品的峰面积均值(Y)对其浓度(X)作图，绘制标准曲线，见图2。对其进行线性回归得回归方程为：Y=5．27×105X-1．31×105，r=0．999 8。从结果中看出，丹参酮ⅡA浓度在23．36  μg/ml～116．80 μg/ml范围内，峰面积与进样量线性关系良好。图2：丹参酮ⅡＡ标准品色谱（略）表1：丹参酮ⅡＡ标准曲线数据浓度浓度(略)  

    2  结果

　　2．1  样品含量测定  精密称取一定质量的丹参超临界萃取物，加入25 ml棕色容量瓶中，加甲醇至刻度线，稀释至一定倍数，用针筒式油膜过滤器滤过，取20 μl滤液进样。将结果代入回归方程计算

　　2．2  仪器精密度　取丹参酮ⅡA的浓度，进而计算出样品含量。结果见表2，样品色谱图见图3。表2：丹参超临界萃取物中丹参酮ⅡA含量测定结果(略) 取丹参酮ⅡA标准品溶液和丹参超临界萃取物样品溶液各1份，同时进行日内精密度和日间精密度考察。结果见表3，表4。图3：丹参超临界萃取样品色谱图（略）
表3：丹参酮ⅡA日内精密度实验结果(略)

　　2．3  丹参酮ⅡA最低检测浓度  按基线噪声2倍计算，丹参酮ⅡA最低检测浓度为0．037 μg/ml。

　　2．4    理论塔板数(以46．72 μg/ml浓度计算)，N=16(tR/W)2=16×(22．6
1/1．01)2=8 013．83

　　2．5  加样回收率试验  精密量取已准确测定含量的丹参酮ⅡA样品溶液适量，共计5份。加入精密称定的丹参酮ⅡA标准品适量，配制成溶液。按“样品含量测定”方法进行测定。结果见表5。表5：丹参酮ⅡA加样回收率测定结果取样相当丹参酮ⅡA质量(略)    
　　3  讨论

　　3．1  SFECO2萃取工艺

　　3．1．1  温度和压力的影响  一般来讲，超临界流体温度和压力的变化，均会对提取率有一定的影响，本实验对超临界的温度和压力因素进行了考察。实验表明，最佳的萃取温度和压力为：萃取压力30 MPa，萃取温度45 ℃；分离釜Ⅰ压力16 MPa，温度40 ℃；分离釜Ⅱ压力8 MPa，温度33 ℃。

　　3．1．2  改性剂的影响  超临界CＯ2流体的极性与正己烷相似，因此在萃取极性成分时，一般加入少量极性溶剂；萃取脂溶性成分时，加入少量非极性溶剂，以改善萃取效果。丹参酮ⅡA为脂溶性成分，所以，我们试用了乙醇和丙酮，以丙酮萃取丹参酮ⅡA效果最好，提取率高。

　　3．1．3  与传统提取法比较  用传统提取法提取丹参中有效成分，提取率低，溶剂使用量大，有效成分亦遭到破坏，而采用SFECO2法萃取丹参，使丹参酮ⅡA的提取率明显提高，萃取时间减少，溶剂量减少，相对低温操作，保持了丹参中有效成分的天然品质，而且不存在有机成分的残留，是一种较为理想的提取方法。

　　3．2  HPLC条件的选择  本实验试用了不同比例的流动相及不同的流速，结果当流动相为甲醇∶水=75∶25，流速为1．0 ml/min时，丹参酮ⅡA的分离效果和峰形最好。本实验也通过紫外分光光度计对丹参酮ⅡA在200 nm~400 nm范围内进行扫描，发现丹参酮ⅡA在270 nm处吸收度最大，故检测波长选择270 nm。本实验的检测条件与《中华人民共和国药典》［4］(2000年版)中对丹参中丹参酮ⅡA的含量测定的HPLC条件相符。

　　3．3  实验时应注意的问题  从日间精密度的测定结果来看，RSD值较大，这与丹参酮ⅡA对光敏感、易分解变质［6］的不稳定性质有关，故丹参酮ⅡA溶液应放于棕色容量瓶中，在冰箱中保存。测定时应即配即取即测。

　　3．4  本法优点  本实验采用SFECＯ2法萃取丹参中丹参酮ⅡA，操作简便，只需将样品称量准确，直接进样入萃取池中，调好温度和压力，加入改性剂后即可自动进行萃取。SFEHPLC法联用提取测定丹参中丹参酮ⅡA快速、简便、准确、灵敏、可重复性强。

　　4  结论

　　用超临界流体萃取丹参的最佳萃取条件为：萃取压力30 MPa，萃取温度45 ℃；分离釜Ⅰ压力16 MPa，温度40 ℃；分离釜Ⅱ压力8 MPa，温度33 ℃；CＯ2流量为3．3 L/h；萃取时间6 h，改性剂用丙酮，流速为0．3 L/h。最佳色谱条件：ODSC18柱(4．6 mm～250 mm)，流动相为甲醇∶水(V∶V=75∶25)，紫外检测波长270 nm，流速1．0 ml/min。丹参酮ⅡA浓度在23．36 μg/ml～116．80 μg/ml范围内，峰面积与进样量线性关系良好，平均回收率为99．12％，RSD=1．99％。本实验建立了超临界流体萃取技术和高效液相色谱技术联用提取并测定丹参中主要成分丹参酮ⅡA含量的方法。总之，无论从操作的简便性还是从实验的结果上看，超临界流体萃取技术对提取丹参中主要成分丹参酮ⅡA是一项理想的分离手段，而用高效液相色谱法测定其有效成分操作简便，结果准确。

　　：

　　［1］  陈向荣，陆京伯，石汉平．丹参的药理作用研究新进展［J］．药学杂志，2001，21(1)：4445．

　　［2］  梁勇，羊裔明，袁淑兰．丹参酮药理作用及临床应用研究进展［J］．中草药，2000，31(4)：304．

　　［3］  Omitsuka M．New platelet Aggregation inhibitors from Tanshen Chem Pharm Bull Japan，1983，31(5)：1670．

　　［4］  国家药典委员会．中华人民共和国药典［S］.2000年版一部．2000.

　　［5］  葛发欢，王海波．超临界流体萃取技术在天然产物提取及药物分析中的最新研究进展和前景［J］．中成药．1997，19(1)：4546．

　　［6］  卢文彪，曾元儿，钟镜金，等.丹参制剂中丹参酮ⅡA的稳定性影响因素考察［J］.JF时珍国医国药，2002，13(1)：7.