锌对铅中毒大鼠海马nNOS神经元的影响

                              作者：熊伟，赵英，万炜，陈锋，李素云

【摘要】  目的：探讨锌对铅暴露大鼠海马nNOS神经元的保护作用。方法：4周龄健康Wistar雄性大鼠48只，分为对照组、铅中毒组、葡萄糖酸锌预防组和葡萄糖酸锌组，每组12只。对照组用去离子水灌胃40 d；铅中毒组大鼠用15 mg/(kg·bw·d)醋酸铅灌胃30 d，去离子水灌胃10 d；锌预防组用30 mg/(kg·bw·d)葡萄糖酸锌和15 mg/(kg·bw·d)醋酸铅联合灌胃30 d，后用去离子水灌胃10 d；锌治疗组用15 mg/(kg·bw·d)醋酸铅灌胃30 d，后用30 mg/(kg·bw·d)葡萄糖酸锌灌胃10 d；对照组、铅中毒组、锌预防组和锌治疗组在第40天处死大鼠取海马，分别进行NOS活性测定；β?NADPH组织化学方法观察海马nNOS数量的变化。结果：锌预防组和锌治疗组大鼠海马NOS活性高于铅中毒组而低于对照组；锌预防组大鼠海马NOS活性高于锌治疗组；在CA1区和齿状回，除锌预防组外，其它各组nNOS阳性神经元数量明显低于对照组，反应强度变弱；锌预防组和锌治疗组nNOS阳性神经元数量高于铅中毒组；锌预防组大鼠海马nNOS阳性神经元数量高于锌治疗组。结论：补锌对铅中毒大鼠海马nNOS神经元的活性和数量都有提高，预防性补锌的效果更好。
　　

【关键词】  锌；铅暴露；海马；nNOS神经元

　　Influence of Zinc on lead poisoning Hippocarnpus nNOS Neuron Rats　　
　　Abstract：Objective To approach protective effect of zinc on lead poisoning hippocampus nNOS neuron of rats.Methods 4 weeks old male wistar rats were divided into 4 groups randomly: blank group、 lead poison group、precaution group with Zinc Gluconate and therapy group with Zinc Gluconate. The blank group， administrated intragastrically with the deionized water for 40 days ; The Lead poisoned group， administered intragastrically with 15 mg/(kg·bw·d) lead acetate for 30 days and with the deionized water for next 10 days; The precaution group， administered intragastrically with 15 mg/(kg·bw·d) lead acetate and 30 mg/(kg·bw·d) Zinc Gluconate for 30 days and with the deionized water for next 10 days ;The therapy groups， administered intragastrically with 15 mg/(kg·bw·d) lead acetate for 30 days，followed by treatment with 30 mg/(kg·bw·d) Zinc Gluconate for next 10 days; On 40th days，the vats wero killed and the activity of NOS of hippocampus was measured. The nNOS positive neuron amount was measured by β?NADPH histochemistry. Results The activity of NOS of hippocampus of the precaution group and the therapy group was higher than the lead poisoned group and was lower than the blank group; The activity of NOS of hippocampus of the precaution group was higher than the therapy group; At CA1 area and dentate， the nNOS positive neuron amount was smaller in all groups except for the precaution group than the blank group. The hippocampus nNOS positive neuron amount was higher in the precaution group and the therapy group than in the lead poisoned group. The nNOS positive neuron amount of hippocampus of the precaution group was higher than the therapy group .Conclusion The activity of NOS and nNOS positive neuron amount of hippocampus were elevated by reinforcing zinc， furthermore， Prophylactic reinforcing zinc was preferably well.
　　
　　Key words: Zinc； Lead exposure； Hippocampus； nNOS neuron
   
　　铅对儿童的损害以CNS的损害为主，最普遍的表现形式是智力和行为的异常［1］。然而，目前铅中毒的治疗方法并不理想，铅中毒的传统治疗是以螯合剂排铅治疗为主，但研究表明：螯合剂排铅可导致体内钙、铁、锌、硒等元素的缺乏［2］，而这些元素对儿童的生长发育极为重要，其中锌与学习、记忆功能密切相关。海马既是脑锌含量最高分布区之一，又是铅神经毒性作用的敏感部位。海马结构参与外周空间的定位、传入性刺激的分析和整合以及记忆的贮存［3］。探讨锌对铅中毒CNS损害的预防和治疗作用及机制，为临床应用锌治疗儿童铅中毒提供动物实验资料及理论依据。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  实验动物  4周龄健康Wistar雄性大鼠，由南华大学实验动物中心提供(SYXK湘2004?0011)。

　　1.1.2  主要试剂和设备  醋酸铅：分析纯(99.5%)(温州化学试剂有限公司)；葡萄糖酸锌颗粒：(国药准字H13021503神威药业有限公司)；一氧化氮合酶(NOS)测试盒(分型)；β?NADPH(Sigma公司)；NBT(Sigma公司)。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  动物分组与模型制备  4周龄健康Wistar雄性大鼠48只，体重(55.727±5.895) g。随机分为四组，12只/组，分别为对照组、铅中毒组、葡萄糖酸锌预防组、葡萄糖酸锌治疗组。适应性喂养5 d后进入实验。实验过程中，所有的大鼠均饮用去离子水，普通颗粒饲料喂养，塑料笼内饲养。对照组用去离子水灌胃40 d；铅中毒组大鼠用15 mg/(kg·bw·d)醋酸铅灌胃30 d，后用去离子水灌胃10 d；锌预防组用30 mg/(kg·bw·d)葡萄糖酸锌和15 mg/(kg·bw·d)醋酸铅联合灌胃30 d，后用去离子水灌胃10 d；锌治疗组用15 mg/(kg·bw·d)醋酸铅灌胃30 d，后用30 mg/(kg·bw·d)葡萄糖酸锌灌胃10 d。对照组、铅中毒组、锌预防组和锌治疗组在第40天处死大鼠取海马，分别进行NOS活性测定；β?NADPH组织化学观察海马nNOS数量的变化。

　　1.2.2  海马NOS(分型)活性检测  按试剂盒说明书操作，波长530 nm处，用去离子水调零，1 cm光径比色杯，测各管吸光度。按说明书NOS和iNOS活力。

　　1.2.3  海马组织冰冻切片β?NADPH酶组织化学。

　　1.2.3.1  脑组织切片的制备  用10%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠，常规灌注、固定，浸糖后，冰冻恒冷切片机中冰冻切片(片厚20 μm)、贴片，后进行β?NADPH组织化学染色。

　　1.2.3.2  β?NADPH组织化学  将贴好的切片置湿盒内，加β?NADPH反应液2滴/张，盖严湿盒，温箱内37 ℃孵育1 h，切片呈现蓝紫色，镜下控制颜色深浅。用0.1 M PBS终止反应后依次放入70%、85%、95%的酒精和无水酒精中各3 min，梯度脱水，放入二甲苯2次各5 min透明，中性树胶封片。

　　1.2.4  资料收集  数据分析用SPSS 12.0统计软件处理，所有数据均以均数±标准差(±s)表示，数据分析先采用单因素方差分析(One?Way?ANOVA)，各处理组结果有差异时，再用LSD?t法进行组间两两比较，确定P≤0.05为差异有显著性。

　　2  结果

　　2.1  海马NOS活性的检测  见表1。

　　表1  锌对染铅大鼠海马NOS活性的影响(±s)

　　2.2  β?NADPH酶组织化学显示nNOS阳性神经元  各组大鼠在海马各区都有nNOS阳性神经元分布，CA1区的nNOS阳性神经元细胞散在分布于锥体底层、辐射层和腔隙分子层。细胞多为圆形、椭圆形的中小型细胞，偶有菱形、锥形的细胞，呈深蓝色。CA3区nNOS阳性神经元相对较少，齿状回的nNOS阳性神经元多紧贴颗粒细胞层的内缘排列。在CA1区和齿状回，除锌预防组外其他各组nNOS阳性神经无数量明显低于对照组，反应强度变弱，见表2。

　　表2  锌对大鼠海马各区nNOS阳性神经元数量影响(略)

　　2.3  海马神经元细胞分析  镜下可见，对照组海马神经元结构清晰，胞浆内充满深蓝色尼氏体；铅中毒组海马神经元尼氏小体明显减少。平均灰度值和尼氏体染色深度成反比。锌预防组的海马神经元平均灰度值低于铅中毒组而高于对照组，差异有显著性(P＜0.05)；锌组平均灰度值与铅中毒组差异无显著性，见表3。

　　表3  锌对染铅大鼠海马神经元细胞平均灰度值影响(略)

　　3  讨论
　　
　　NOS是体内催化L?Arg合成NO的唯一酶类，可分为nNOS、eNOS和iNOS三种(eNOS和iNOS合称为cNOS)。nNOS主要在神经元细胞中表达。在多种组织中NADPH?d被认为是nNOS［4］。β?NADPH组织化学染色可以显示哺乳类动物CNS内的含nNOS神经元［5］。海马是学习记忆的中枢，本文研究发现，正常大鼠大脑海马各区中都存在nNOS阳性神经元;有研究表明，进行训练学习的大鼠海马各区nNOS神经元数量及染色强度明显增加，但皮层和纹状体区则无明显变化，提示由海马的nNOS催化形成的NO对学习记忆过程尤为重要［6］。本研究中，染铅组大鼠海马CA1和齿状回的nNOS阳性神经元数量比对照组明显减少，锌预防组和锌治疗组nNOS阳性神经元数量高于铅中毒组(P＜0.05)而低于对照组(P＜0.05)，锌预防组大鼠海马nNOS阳性神经元数量高于锌治疗组(P＜0.05)。iNOS在正常脑组织中不表达，但病毒感染后免疫激发或外伤后的星形细胞和小胶质细胞中可诱导产生。在生理状态下，细胞内cNOS能催化L?Arg生成低浓度的NO，在学习和记忆等生理过程中发挥重要作用。NO可作为信息分子，弥散到突触后膜，激活鸟苷酸环化酶，神经递质谷氨酸释放增加，从而使对LTP效应的维持起促进作用［7］。在病理状态下，iNOS可以合成nmol水平的NO，比cNOS合成的NO浓度高1 000倍［8］，高浓度的NO可以引发神经毒性，可诱导神经细胞凋亡，导致神经系统各种功能损害。铅可降低海马内NOS活性，而iNOS活性增强［9］。本研究结果显示：铅中毒组海马NOS活性降低、iNOS活性增加。多数学者认为：铅是通过抑制海马NOS活性，使NO产生减少，从而抑制海马LTP形成导致认知功能障碍。但本次研究结果提示：铅中毒时CNS的损害也可能是由iNOS催化产生的高浓度NO对神经细胞的毒性作用引起的。锌是维持NOS活性形式同型二聚体结构的重要组成部分，它周围发生任何立体化学改变都会影响NOS的活性［10］。本文研究如表1所示，锌预防组和锌治疗组大鼠海马总NOS活性高于铅中毒组而低于对照组(P＜0.05)；锌预防组大鼠海马总NOS活性高于锌治疗组(P＜0.05)。锌预防组和锌治疗组大鼠海马iNOS活性低于铅中毒组而高于对照组(P＜0.05)。关于铅中毒的锌的预防和治疗效果比较研究，Flora［11］等作了一次报导。Flora等用维生素B1联合锌对染铅大鼠进行驱铅治疗发现：染铅同时给大鼠补锌与染铅造成铅中毒后再补锌治疗相比，前者更能降低铅在肝、肾等器官的蓄积，增加尿液中铅的排出量；提高血液δ?ALAD的活性。提示染铅同时补锌比铅中毒后补锌治疗更能有效的拮抗铅毒性。本次研究中，预防组(染铅同时补锌)海马NOS的活性高于治疗组；锌预防能拮抗铅对大鼠海马神经元细胞的损伤。研究证明，染铅同时给锌比铅中毒发生后补锌治疗对铅毒性的拮抗更加有效。综上所述，亚急性铅中毒时wistar大鼠海马的NOS等酶的活性降低和iNOS活性升高，大鼠海马CA1区和齿状回nNOS阳性神经元数量减少，补锌能够一定程度上逆转这种改变，减轻铅中毒大鼠海马的损害。研究中几乎所有指标都显示，染铅同时补锌和铅中毒发生后补锌相比，前者对铅毒性的拮抗作用，更为明显，说明预防比治疗更有效。锌虽然在一定程度上能拮抗铅对海马的损害，但研究数据表明，预防和治疗均不能使大鼠海马的各项指标恢复到对照组水平，因此，降低儿童铅中毒的损害的主要办法应该是降低环境中铅浓度，平衡营养，以此降低儿童铅的摄入。

【】
  　　［1］ Lidsky TL.Schneider JS.Lead neurotoxicity in cjildren:basic mechanisms and clinical correlates［J］.Brain，2003，126(Pt1):5?19.

　　［2］ Powell JJ，Burden TJ，Greenfield SM，et al.Urinary excretion of essential metals following intravenous calcium disodium edentate:an estimate of free zinc and zinc status in man ［J］.Inorg Biochem，1999，75(3):159?165.

　　［3］ Olton DS， Walker JA， Wolf WA， et al. A disconnection analysis of hippocumpal function［J］. Brain Rcs，1982，233(2):241?253.

　　［4］ Dawson TM， Bredt DS， Fotuhi M，et al.Nitric oxide synthase and neuronal NADPH diaphorase are identical in brain and peripheral tissues［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，1991，88(17):7797?7801.

　　［5］ 雷德亮，罗学港，Peter R.等.神经元性一氧化氮合酶活性在app/ps1双转基因AD模型小鼠皮质和海马的分布［J］. 神经解剖学杂志，2004，20(4)：377?382.

　　［6］ 刘辉，陈俊抛，田时雨等.神经元型一氧化氮合酶在学习记忆过程中的变化和作用［J］.神经免疫学和神经病学杂志，2000，7(2): 116?122.

　　［7］ 张军，金亚平，张杨等. 铅神经毒性分子机制的研究进展［J］.中国公共卫生杂志，2003，19(8):1004?1006.

　　［8］ 李倬.一氧化氮的生物学意义及应用前景［J］.西北民族学院学报(版)，2001，42(3)：39?43.

　　［9］ Garcia?Arenas G，Claudio L，Perez?SeverianoF， et al.Lead acetate exposure inhibits nitric oxide synthase activity in capillary and synaptosomal fractions of mouse brain［J］. Toxicol Sci，1999，50(2):244?248.

　　［10］ Scheele JS， Bruner E， Zemojtel T， et al. Kinetics of CO and NO Ligation with the Cys331?Ala Mutant of Neuronal Nitric?oxide Synthase［J］. J Biol Chem，2001， 276(7): 4733?4736.

　　［11］ Flora SJ，Singh S， Tandon SK， et al. Thiamine and zinc in prevention or therapy of lead intoxication［J］. J Int Med Res，1989，Jan?Feb，17(1):68?75.