PCR技术克隆SD大鼠全长长细胞内段形式瘦素受体基因cDNA

【摘要】  目的：探讨瘦素作用机制、了解瘦素及瘦素受体对代谢的影响，为下一步实验，表达重组体的构建提供了方便。方法：以逆转录多聚酶链扩增（RT?PCR）克隆长细胞内段形式瘦素受体（OBRb）基因cDNA。结果：成功克隆长细胞内段形式瘦素受体（OBRb）基因cDNA。结论：为进一步研究瘦素与瘦素的生理作用和作用机制的系列研究打下实验基础。

【关键词】  瘦素；瘦素受体；逆转录多聚酶链扩增

　　RT?PCR Cloning for OBRbcDNA Gene of Leptin Receptor in Long Intracellular Domain　　
　　Abstract:Objective To appraise effect principles of Leptin and study the influence of metabolism by Leptin and Leptin Receptor,so that it can offer the convenience of recombinant construction in the further experiment.Methods RT?PCR Clones for OBRbcDNA Gene of Leptin Receptor in Long Intracellular Domain.Results It succeeds to clone for OBRbcDNA Gene of Leptin Receptor in Long Intracellular Domain.It lays a experiment foundation for the studying of physiological effect and structure of Leptin and Leptin Receptor.
　　
　　Key words:Leptin;Leptin Receptor;RT?PCR
   
　　肥胖症的分子发病机制多年来一直不清楚，1994年瘦素基因（OB基因）和1995年瘦素受体（OBR基因）的成功克隆［1,2］，使肥胖的分子发病机制研究进入了新的时代。目前已知瘦素与瘦素受体结合，通过下丘脑中枢和外周组织两条途径，经一系列机制降低食欲、调节能量代谢及维持体重平衡，并参与糖、脂肪的代谢调节。体内瘦素受体蛋白存在多种异构体，它们的生理作用和作用机制未完全明确，目前认为长细胞内段式瘦素受体是介导瘦素作用的主要形式，但细胞内段形式瘦素受体的功能意义尚不清楚。为探讨瘦素作用机制,了解瘦素及瘦素受体对代谢的影响，本实验仅介绍通过逆转录多聚酶链扩增（RT?PCR）克隆全长长细胞内段形式瘦素受体（OBRb）基因cDNA。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  实验动物  正常SD大鼠，体重约250 g，购自中山医科大学动物实验中心。

　　1.1.2  主要试剂  RNeasy Mini Kit购自QIAGEN公司，First Strand cDNA Synthesis Kit for RT?PCR（AMV）和ExpandTM High Fidelity PCR System购自Roche公司，Qiaquick Gel Extraction Kit和Plasmid Qiaprep Spin Miniprep Kit购自QIAGEN公司，琼脂糖、pMD18T和限制性内切酶Xba Ⅰ、Sma Ⅰ、Sph Ⅰ、EcoRV、Hinc Ⅱ、T4DNA连接酶购自TakaRa Biotech公司，JM109由本院林百欣医学实验中心提供。

　　1.1.3  主要仪器  紫外分光光度仪（日本岛津），PCR仪（Barnstaed Thermolyne，USA），高速低温离心机（Htelich，Universal 32R，American），台式离心机（Eppendorf），凝胶成像（上海复旦），37 ℃恒温水浴箱（SHZ?88台式水浴恒温振荡漾器），低温水浴箱（HoeferRCB 500）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  引物设计  根据机软件设计,包含了OBRb基因的部分细胞外段、跨膜段和长细胞内段编码区，全长1 355 bp。为了方便构建重组质粒时与载体的连接，分别其在上游（2 133?2 158）和下游引物（3 489?3 465）的5＇端加上Xba Ⅰ、Sma Ⅰ的限制性酶切位点，引物序列为：5＇?GGTCTAGATTCTGGCCATCAATTCCATCGGTGC?3＇5＇?CTCCCGGGTTACACAGTTAAGTCACACATCTT?3＇引物由Takara Biotech公司合成（下画线的部分为酶切位点）。

　　1.2.2  SD大鼠下丘脑总RNA的制备  腹腔内注射戊巴比妥钠（按35 mg/kg体重）麻醉大鼠,取下丘脑组织，立即置于装有裂解液的试管内，用Rotor stator匀浆器把下丘脑组织磨碎并匀浆，按Rneasy Mini Kit操作步骤抽提总RNA，测定OD值并电泳，以判断抽提的RNA质量。

　　1.2.3  RT?PCR  总RNA 1 μg、10倍逆转录反应缓冲液2 μl、MgCl2 100 mmol、4种单核苷酸各20 mmol、序列特异性引物75 poml、RNA酶抑制剂50 U、AMV逆转录酶20 U，加无菌水使反应体积达20 μl、42  ℃孵育1 h进行逆转录反应，99 ℃ 5 min使酶失活。为了扩增OBRb cDNA片段，在一个50 μl的反应体系中进行PCR，并对反应体系中cDNA、引物和MgCl2量、退火温度、退火时间、适伸时间以及反应的循环次数进行了优化，最终反应体系中包含10倍PCR反应缓冲液5 μl、4种单核苷酸各10 mmol、MgCl2 100 mmol、上下游引物各17 poml、cDNA 1 μl、酶混合物2.6 U，94 ℃孵育1 min后，以94 ℃ 30 s、62  ℃ 45 s、72 ℃ 100 s反应条件扩增30个循环。扩增产物电泳后照相，按Qiaquick Gel Extracion Kit操作说明回收目的DNA，紫外分光光度法测定其含量，并经SphI酶切初步鉴定。

　　1.2.4  携有OBRb cDNA片段的重组质粒（pMD180BRb）的构建及鉴定  上述回收的扩增产物和质粒pMD18T进行连接；转化感受态大肠杆菌JM109，通过蓝白斑筛选出阳性菌落；再经限制性酶切和PCR初步鉴定，PCR反应条件同上；同时以XbaI或SmaI酶切鉴定连接方向。

　　1.2.5  SD大鼠全长长细胞内段形式瘦素受体基因cDNA的克隆  以下丘脑RNA为模板进行RT?PCR，构建载有pMD180BRa的方法同前。用EcoRV、XbaI双酶切pMD180BRa和pMD180BRb，前者切除223 bp（包含了部分细胞外段、跨膜段和短细胞内段编码区），回收5.1 kbp片段，后者则回收1.0 kbp(包含了部分细胞外段、整个跨膜段和长细胞内段编码区)，分别取0.1 μg和0.3 μg，加10倍连接反应缓冲液2 μl和限制性切酶1 μl，加水至20 μl，37 ℃温浴2 h，将两种DNA片段进行定向连接，转化大肠杆菌JM109，筛选出载有SD大鼠全长长细胞内段形式瘦素受体编码序列的克隆，提取质粒，紫外分光光度法测定质粒DNA含量，经酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定，并照相。最后，采用与载体或OBRb cDNA特异序列互补的引物，通过双脱氧链终止法进行OBRb cDNA的核苷酸序列分析（ABI373自动DNA测定仪，Perkin?Elmer公司，由Takara Biotech公司完成）。

　　2  结果

　　2.1  下丘脑总RNA的制备  从SD大鼠（250 g）下丘脑共提取总RNA约9 μg，A260/A280为1.9，电泳显示18 S和28 S,条带比例约1∶2。

　　2.2  RT?PCR产物的酶切分析  RT?PCR产物为一条约1.35 kb的双链DNA,经SphⅠ酶切后得片段790 bp和560 bp。

　　2.3  重组质粒（pMD180BRb）的酶切分析  RT?PCR产物定向插入质粒pMD185，重组质粒经XbaI、SmaI酶切后得片段约2.6 kb和1.35 kb。

　　2.4  核苷酸序列分析  以起始密码子腺苷酸为1开始编号的编码区核苷酸序列重叠，由C→A出现变异。为排除RT?PCR的误读，以同一RNA为模板，再次进行RT?PCR，产物序列分析结果显示，在同一RNA为模板，再次进行RT?PCR，产物序列分析结果显示，在同样位点出现同样的变异。

　　2.5  载有SD大鼠全长OBRb编码序列的克隆质粒酶切分析将约1.0 kbp的DNA片段定向插入线性化的5.1 kbpDNA片段中,获得的阳性克隆中载有编码SD大鼠全长长细胞内段形式瘦素受体基因，全长约618 bp，HindⅢ和XbaⅠ双酶切该质粒得片段2 692 bp和3 489 bp，HincⅡ酶切后得片段568 bp、1 758 bp，均与理论值一致。

　　3  讨论
　　
　　瘦素受体基因编码是一跨膜蛋白，有相同的细胞外段和跨膜段以及长短不一的细胞内段，因全长OBRa cDNA和OBRb cDNA片段较长，故采取分段扩增克隆，再连接成全长的OBRa cDNA和OBRb cDNA；实验中制备了高纯度高质量总RNA，在RT?PCR过程中，优化了第一链cDNA、MgCl2和引物的加入量、以及退火温度、退火时间、廷伸时间，并采用高保真酶反应系统，从而保证了扩增产物的特异性、保真性和扩增效率；在重组体构建时，采用pUC 18T载体和高效连接缓冲液，使连接更具效率，并且在引物5＇端和3＇端加上限制性内切酶酶切位点，使扩增片段的连接更为方便快捷，并保证了其方向性及碱基序列的正确性，同时也为后续表达重组体的构建提供了方便；以相同RNA进行的两次RT?PCR序列分析结果相同，即OBRa cDNA序列228位T→C和515位T→C的变异，前者76位编码的氨基酸仍为甘氨酸（Gly），后者则使编码的氨基酸（Leu）→丝氨酸（Ser），OBRb长细胞内段3 051位核苷酸C→A，其1 017编码的氨基酸仍为丝氨酸，其余序列与报道的一致。

【文献】
  　　［1］ Zhang Y,Proenca R,Maffei M,et al.Positional cloning of the mouse gene and its human homologue［J］.Nature,1994,372:425?432.

　　［2］ Tartaglia LA.Identification and expression cloning of a leptin receptor,OB?R［J］.Cell,1995,83:1262?1271.