Bax蛋白在丁酸钠诱导食管癌细胞凋亡中的表达

【摘要】  目的：探讨丁酸钠对人食管癌Eca?109细胞凋亡的作用。方法：以1 mmol/L、2.5 mmol/L和5 mmol/L丁酸钠分别与人食管癌Eca?109细胞共培养，倒置显微镜观察细胞生长情况，免疫组化（SP)法检测凋亡抑制基因bax蛋白的表达。结果：Eca?109细胞经丁酸钠处理后，在倒置显微镜下观察到丁酸钠处理后的Eca?109细胞形态学发生了改变，细胞生长明显受到抑制；免疫组化检测实验组细胞的bax蛋白表达阳性率低于对照组，具有统计学意义(P<0.05)。结论：丁酸钠可诱导食管癌Eca?109细胞凋亡，其机制与下调凋亡抑制基因bax蛋白表达有关。 
【关键词】  丁酸钠 食管癌细胞 凋亡
　　the  Expression of the Bax  Proteinum of Sodium Butyrate on Apoptosis in Human Esophageal Carcinoma Cells Eca?109 in Vitro
    Abstract:  Objective：To investigate the effects of sodium butyrate （NaB） on apoptosis in human esophageal carcinoma cells Eca?109 in vitro. Methods： Eca?109 cells was treated with NaB in concertrations of 1 mmol/L, 2.5 mmol/L, 5 mmol/L.Immunohistochemical staining was used to detect the expressions of bax in cells. Results ：Some morphologic features of apoptosis  were examined by microscopy. The expression rates of the bax in the test group were lower than the control group(P <0.05). Conclusions: NaB could promote the apoptosis in human esophageal carcinoma cells Eca?109. the mechanism of the process may be related to inhibiting the expression of the bax  proteinum.
    Key word：sodium butyrate; esophageal carcinoma cells; apoptosis.
    丁酸钠(Sodium butyrate, NaB)是一种短链脂肪酸，可由植物纤维在肠分解而成，它是一种动物代谢所需的天然成分。其生理浓度可以引起多种生物效应，被认为是一种基因表达的调控剂，可以促细胞生长、分化和凋亡［1］，也可用于癌症［2］。有报道正常结肠上皮需要一定浓度丁酸钠方可维持其增殖和分化，撤去丁酸钠引起细胞凋亡［1］。许多研究也表明NaB可以诱导包括乳腺癌、前列腺癌、胶质瘤、白血病等多种体外培养的细胞凋亡［2，6］。但NaB用于治疗食管癌的实验研究国内外报道甚少，为此我们将NaB与人食管癌Eca?109细胞共培养，观察NaB诱导食管癌细胞凋亡的作用，探讨其作用机制。
　　1  材料和方法
　　1.1  细胞培养 
　　人食管癌细胞Eca?109购自院上海细胞生物学研究所，接种于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。
　　1.2  丁酸钠处理 
　　丁酸钠(Sigma公司)，用PBS配成500 mmol/L贮存液，-20℃保存。丁酸钠药物作用分3组，浓度分别为1 mmol/L、2.5 mmol/L、5 mmol/L，并设不加药的阴性对照组，分别于作用24 h后收集细胞。
　　1.3  光镜观察 
　　取对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化计数，用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1×105/ml，接种于24孔培养板，2 ml/孔，孵育24 h后观察细胞已贴壁，吸弃原培养液。实验组每孔分别加入终浓度为1.0 mmol/L、2.5 mmol/L、5.0 mmol/L NaB的培养液2 ml，对照组加不含NaB的培养液2 ml，分别培养24 h、48 h、72 h后，在倒置显微镜下观察细胞生长形态，用WinFast PVR软件记录结果并拍照。
　　1.4  免疫组化检测Eca109细胞bax蛋白表达 
　　收集细胞，调整浓度为3×105/ml，接种于已置盖玻片的96孔板内，待细胞贴壁后，弃原液，分别加入终浓度为1 mmol/L、2.5 mmol/L、5 mmol/L的NaB培养液，设不加药的为对照组。每组每个浓度设4个复孔，继续培养24 h。取出有贴壁细胞的盖玻片（即细胞爬片），PBS冲洗晾干，95％乙醇固定20 min，进行免疫组化（SP)法染色，操作步骤按SP试剂盒说明书进行，同时设阳性、阴性及空白对照。胞质内出现棕色颗粒为阳性细胞，光镜下（10×20）每个浓度每张爬片随机计数1 000个细胞，每组4张爬片的阳性细胞平均数。鼠抗人bax单克隆抗体及免疫组织化学SP试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
　　1.5  统计学处理 
　　采用单因素方差分析和Poission 分布法检验，以α=0.05为检验水准，为差异有显著性。
　　2   结果
　　2．1  倒置显微镜下观察结果
　　不同浓度NaB作用Eca?109细胞不同时间段后，倒置显微镜下可见，对照组细胞呈多边形上皮样，贴壁生长，似铺路石样，细胞分裂增殖旺盛；而实验组，在1 mmol/L浓度NaB作用下，细胞变小、变为长梭形，并伸出较长突起，趋向成纤维细胞形态；5 mmol/L浓度NaB作用下，随着作用时间延长，细胞变小、变圆，部分细胞从培养瓶壁上脱落下来，漂浮于培养瓶中，细胞生长明显受到抑制。
　　2．2  免疫组化检测凋亡相关基因bax蛋白的表达
　　对照组bax呈强阳性表达，阳性率为63%，随着NaB作用浓度的增大，bax阳性表达越来越弱，其阳性率也逐渐降低（表1），实验组分别与对照组比较有显著性差异（P<0.05），实验组之间比较差异也有显著性（P<0.05）。表1  Eca?109细胞 bax蛋白表达阳性率（略）注：*与各组比较P<0.05。
　　3  讨论
    近年来许多实验研究发现，某些人体内存在的物质可以作为肿瘤生长抑制剂，丁酸钠就是这种抑制剂［1］，它是由结肠共生菌发酵食物纤维产生的一种四碳短链脂肪酸，能在生理浓度下抑制结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胶质瘤、白血病等多种体外培养的细胞生长、促进其分化，使肿瘤细胞出现类似正常细胞的表型，并可诱导细胞凋亡［2，6］，对于食管癌这方面的研究仅见少数报道。本实验将丁酸钠设置不同的作用浓度、不同的作用时间处理食管癌Eca?109细胞，在倒置显微镜下观察到丁酸钠处理后的Eca?109细胞形态学发生了改变，细胞生长明显受到抑制，表明丁酸钠可以诱导体外培养的食管癌Eca?109细胞凋亡。有关丁酸钠诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制尚未完全明确。目前比较明确的是丁酸钠是一种重要的组蛋白去乙酰化抑制剂，通过抑制组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase inhibitor, HDAC）活性，增强组蛋白乙酰转移酶（histone acetyl transferase, HAT）的活性，导致组蛋白高乙酰化，使组蛋白与相邻DNA的接触受抑制，导致染色体结构凝聚从而抑制基因转录，有利于转录因子激活特异性的基因。
    细胞凋亡是机体重要的生理过程，对维持内环境的稳定至关重要，抑制细胞凋亡在肿瘤发生、中的作用日益为学者所重视。本实验应用免疫组化检测凋亡相关基因bax表达率下降，与对照组差异均有显著性（P<0.05），说明丁酸钠能诱导体外培养的人食管癌Eca?109细胞凋亡，其机制与下调凋亡抑制基因bax蛋白的表达有关。这为丁酸钠用于临床食管癌提供了理论和实验依据。然而丁酸钠促进细胞凋亡的分子机制可能非常复杂，其更多的分子机制尚有待于进一步研究。
 
【】
  　　［1］Chen Js, Faller DV, Spanjaard RA. Short?chain fatty acid inhibitors of histone deacetylases: Promising anticancer therapeutics［J］. Curr Cancer Drug Targets, 2003,3(3):219?236.

　　［2］Blottiere HM, Buecher B, Galmiche JP, et al. Molecular analysis of the effect of short?chain fatty acids on intestinal cell proliferation［J］. Proc Nutr Soc, 2003, 62(1):101?106.

　　［3］Chopin V, Toillon RA, Jouy N, et al. P21(WAF1/CIP1) is dispensable for G1 arrest, but indispensable for apoptosis induced by sodium butyrate in MCF?7 breast cancer cells［J］. Oncogene, 2004, 23(1): 21?29.

　　［4］Kuefer R, Hofer MD, Altug V, et al. Sodium butyrate and tributyrin induce in vivo growth inhibition and apoptosis in human prostate cancer［J］. Br J Cancer, 2004, 90(2): 535?541.

　　［5］Tsubaki J, Hwa V, Twig SM, et al. Differential activation of the IGF binding protein?3 promoter by butyrate in prostate cancer cells［J］. Endocrinology, 2002, 43(5): 1778?1788.

　　［6］kamitani H, Taniura S, Watanabe K, et al. Histone acetylation may suppress human glioma cell proliferation when p21 WAF/Cip1 and gelsolin are induced［J］. Neuro?oncol 2002, 4(2): 95?101.