白藜芦醇对早期重症急性胰腺炎大鼠多器官组织氧自由基的影响
作者：秦勇 马清涌 党晓燕 沙焕臣
【摘要】 目的 观察白藜芦醇对早期重症急性胰腺炎(SAP)大鼠器官组织SOD、MDA的影响，进一步研究白藜芦醇的作用机制。方法 将54只大鼠随机分为三组(假手术组、急性胰腺炎组、白藜芦醇组各18只)。应用逆行胰胆管穿刺注射牛黄胆酸钠制备SAP大鼠模型，白藜芦醇溶液通过阴茎背静脉注射，术后4h剖杀,观察腹水量及胰、肝、肺、肾和肠壁组织的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和组织学变化及白藜芦醇对其影响。结果 模型组的胰、肺、肝、肾、小肠组织SOD活性降低、而MDA水平增加；白藜芦醇可明显升高胰、肺、肝、肠、肾组织的SOD活性,降低各组织的MDA水平，同时白藜芦醇可减轻大鼠各器官组织病理损害，以胰腺组织为主。结论 氧自由基参与了SAP的病理生理过程。白藜芦醇可提高SAP大鼠多器官组织SOD活性、降低MDA水平而减轻组织脂质过氧化和组织器官功能损害。
【关键词】 重症急性胰腺炎；白藜芦醇；氧自由基；超氧化物歧化酶；丙二醛
Effect of resveratrol on oxygen free radicals of multiple organs in rats with severe acute pancreatitis of early stage
ABSTRACT: Objective To observe the effect of resveratrol on superoxide dismutase and malondialdehyde of multiple organs in rats with severe acute pancreatitis of early stage. Methods A total of fifty?four rats were divided into three groups (sham group, SAP model group and resveratrol?treated group ). SAP model was made by injecting sodium taurocholate 0.1mL/100g to the pancreatic bile duct, and resvoratrol was given intravenously. The rats were sacrificed at four hours after inducing SAP model. The levels of MDA and SOD and histological changes of pancreas, lungs, liver, kidneys and small intestines were measured. Results The levels of MDA in pancreas, lungs, liver, kidneys and small intestine tissues in model group were significantly higher than those in sham group (P<0.05), while the level of SOD was significantly lower in the tissues involved. The levels of SOD in pancreatic and lung tissues in resveratrol?treated group were significantly higher than those in model group, while the levels of MDA in pancreas, lungs, liver, kidneys and small intestines were significantly lower in the tissues concerned. Conclusion Oxygen free radicals participate in the process of pathological changes in SAP. Resveratrol might increase SOD activity and decrease MDA level, thus attenuating lipid peroxidation in multiple organs of SAP, especially in pancreas and lung tissues.
KEY WORDS: severe acute pancreatitis; resveratrol; oxygen free radical; superoxide dismutase; malondialdehyde
重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是胰腺内部及周边突然发生的坏死和炎症的病理过程。急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)尤其是SAP常并发胰外器官损伤，其机制至今不清[1?3]。近10年来，有研究证实氧自由基(oxygen free radicals, OFR)与AP的发生有密切关系。白藜芦醇[4?5](resveratrol, Res)是一种自由基清除剂，可降低自由基的活性和干扰氧化代谢。本实验旨在研究白藜芦醇对早期SAP大鼠多器官组织氧自由基的影响，探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康成年雄性SD大鼠54只，体重250-300g，西安大学医学院实验动物中心提供。置于实验环境中1周，室温18-22℃。
1.2 实验仪器与试剂 AH6020应用免疫计数器(国营206厂生产)、低温高速离心机(Heraeus instruments, Germany)、牛黄胆酸钠(美国Sigma公司原装生产)，白藜芦醇(西安奥塞斯公司生物工程有限公司)配成相应浓度的溶液(10g/L白藜芦醇混悬液的配制：用前将10mg白藜芦醇加入无菌注射用水1mL中，用时充分摇匀后缓慢注入血管；40g/L牛黄胆酸钠溶液的配制：称取牛黄胆酸钠1g加入无菌注射用水25mL中，低温保存，用时充分摇匀)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.3 实验动物分组 将54只SD大鼠随机分为3组，即假手术组、急性重症胰腺炎组(模型组)、白藜芦醇治疗组(治疗组),每组18只。
1.4 大鼠急性重症胰腺炎模型的制作 大鼠于术前12h禁食，自由饮水，戊巴比妥溶液22mg/kg行腹腔内麻醉、固定。经上腹正中切口入腹，提起十二指肠以小号血管夹分别夹住十二指肠段和肝门部胰胆管。在肝门处用TB针(4.5号针头，1mL注射器)穿刺胰胆管，注射牛黄胆酸钠50mg/kg，持续1min，停留5min，然后拔出针头，去除血管夹。观察到大鼠胰腺组织明显水肿、出血，缝合腹壁各层。此时造模成功。白藜芦醇治疗组于术后5min将10g/L的白藜芦醇溶液通过阴茎背静脉给药。假手术组打开腹腔，翻动胰腺组织后关腹。各组均在手术结束时以10mL/kg一次性皮下注射8.5g/L氯化钠液于大鼠背部，以补充术后大鼠水分。
1.5 观察指标 术后4h，开腹采血致死。①一般观察:观察腹水性状、胰腺、肝、肾、肺、小肠壁外观。②MDA和SOD测定：处死后立即取胰腺、肝、肾、肺、小肠壁组织制成匀浆，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD，硫代巴比妥酸(TBA)比色分析法测定MDA，具体操作严格按说明书进行。③病理形态学观察：动物处死后，取胰腺、肝、肺、肾、小肠组织，100mL/L甲醛固定，石蜡包埋切片，苏木精/伊红(HE)染色，光镜下观察。
1.6 统计学处理 实验数据用±s表示，组间比较用SPSS10.0软件行t检验。P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 腹水及器官大体病观察 术后4h，开腹后假手术组偶见少量清亮腹水，模型组、治疗组均见淡红色腹水，治疗组腹水量较模型组略少。假手术组胰腺的外观未见异常，模型组、治疗组胰腺均可见胰体弥漫性肿胀，浆膜下可见出血斑，胰周少许皂化斑形成。肝、肾、肺、小肠外观各组未见明显异常。
2.2 各组大鼠各器官组织匀浆SOD活性比较 见表1。
2.3 各组大鼠各器官组织匀浆MDA水平比较 见表2。
表1 各组大鼠各器官组织匀浆SOD活性比较（略）
Table 1 Comparison of SOD activity in homogenate from multiple organs
*P<0.01,**P<0.05 vs. sham operation group;△P<0.01,△△P<0.05 vs. model group
表2 各组大鼠各器官组织匀浆MDA水平比较（略）
Table 2 Comparison of MDA levels in homogenate from multiple organs
*P <0.01, **P<0.05 vs. sham operation group; △P<0.01 vs. model group
2.4 各器官组织病结果 假手术组胰腺、小肠、肝、肺、肾结构正常。模型组胰腺可见多处的出血坏死灶，并含有黄色胶冻状半透明物，分叶结构模糊，同时有假囊形成，胰腺间质水肿，腺泡细胞水肿，有散在的腺泡细胞坏死和广泛的炎细胞浸润；组胰腺出血坏死及炎症细胞的浸润程度明显减轻。模型组肺组织间质性水肿，微血管内血栓形成及大量白细胞浸润；治疗组肺组织水肿及白细胞浸润程度明显减轻,血栓减少。模型组可见回肠粘膜间质充血水肿，淋巴管扩张，单核细胞及中性粒细胞浸润，柱状上皮细胞坏死脱落，绒毛水肿增粗，高度缩短，排列紊乱，部分有断裂、缺损；治疗组肠黏膜上皮及绒毛形态基本完整。模型组部分肾小球坏死溶解，肾小管上皮明显变性，细胞界限模糊,管腔变窄或闭塞或充满蛋白性水肿液，部分出现片状肾小管坏死；治疗组肾小球结构正常，肾小管上皮变性，管腔存在。模型组肝组织可见肝窦瘀血，肝细胞水肿，炎细胞浸润；治疗组上述病变明显减轻。
3 讨论
3.1 SAP多器官功能损伤与氧自由基的关系 研究发现，SAP时炎性细胞通过扳机样作用引发炎症介质和细胞因子的瀑布样级联反应，使AP易于从局部迅速成全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)和并发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)。缺血?再灌注损伤时伴随着大量氧自由基的释放,是MODS发生的重要机制之一。
自由基是指具有不配对的原子、原子团、分子和特殊状态的大分子。由氧诱发的自由基称为氧自由基(oxygen free radicals, OFR)，氧自由基活性常通过其引发的脂质过氧化产物来反映。在正常生理条件下，氧自由基的产生与清除保持平衡。当氧自由基的清除系统功能下降，导致活性氧对胰腺的损害。氧自由基可以使蛋白质、核酸、脂质和多糖等大分子损害，使胰腺的毛细血管通透性增加，导致胰腺水肿、出血和组织变性、坏死。氧自由基还可使膜的稳定性降低，导致胰腺腺细胞溶酶体内各种胰酶释放、活化；氧自由基又可激活磷脂酶A，从而使胰腺细胞膜上的卵磷脂分解，进一步造成胰腺组织的损伤。
抗氧化酶SOD和脂质过氧化反应产物MDA的含量可反映自由基水平。本实验发现，模型组中，胰腺、小肠、肝、肺、肾组织的MDA水平明显高于假手术组,且模型组大鼠上述器官出现相应的病理学损害，表明SAP早期胰腺、小肠、肝、肺、肾组织发生的脂质过氧化，引起相应器官的损害。另一方面，伴随着组织MDA水平的升高，模型组大鼠胰腺、小肠、肝、肺、肾组织的SOD活性明显低于假手术组，表明SAP早期各器官组织中抗氧化剂SOD消除自由基不足，也导致相应组织脂质过氧化的发生，从而介导了相应器官的损害，其中以胰腺、肺最明显。
3.2 白藜芦醇对早期SAP氧自由基的影响 白藜芦醇又称芪三酚，它是植物体内用于抵抗病原侵犯的一种二苯乙烯芪类多酚物质[6]，是一种自由基清除剂，通过清除自由基和干扰氧化代谢两种机制起作用[7]。白藜芦醇可升高仓鼠肺成纤维细胞中SOD、过氧化氢酶、谷胱苷肽还原酶(GSH?Px)的活性，从而阻止氧化性损伤[8]。莫志贤等的研究表明：白藜芦醇在一定范围内对过氧化氢所致的小鼠肝细胞氧化损伤有明显的抗氧自由基作用,能提高肝细胞的SOD和GSH?PX活性，减少GSH的消耗，降低MDA含量，从而减轻氧化物对肝细胞的损害。表明白藜芦醇可通过抗氧自由基而保护MODS脏器的功能。
AP的发生机制目前尚不十分明确，有研究表明，自由基参与AP时胰腺水肿的形成过程，并可能参与胰腺的坏死进程。1988年Wisner等在雨蛙素诱导的鼠急性胰腺炎模型中发现，氧自由基、过氧化物在AP发病中起重要作用。
本研究表明治疗组大鼠各器官MDA水平下降，器官组织病理改变减轻。MDA是脂质过氧化的终产物之一，其下降反映脂质过氧化的减少，提示白藜芦醇减轻大鼠各器官组织病理损害，可通过减轻脂质过氧化物对器官组织损伤而发挥作用。同时，SOD作为一种抗氧化剂，治疗组SOD水平较模型组升高，也说明白藜芦醇能减轻氧自由基的生成，减轻脂质过氧化物对胰腺组织损伤。
综上所述：SAP的发生与体内氧自由基的释放和清除机制的紊乱有关，早期存在着多器官组织脂质过氧化；白藜芦醇可提高组织SOD活性而降低MDA的活性，从而减少氧自由基的生成，减轻SAP早期多器官的损害，为白藜芦醇在SAP中的应用提供理论基础。
【】
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