大黄素、黄芪多糖在体外对乙型肝炎病毒的抑制作用

                   作者：党双锁　张正国　张欣　宋平　边静　程延安

【摘要】  　　目的 体外观察大黄素、黄芪多糖单用与联合应用抗HBV的作用。方法 以HepG2.2.15细胞为研究模型，选用干扰素α、拉米夫定为阳性对照药物，观察培养液中加入不同浓度大黄素、黄芪多糖及两药联合应用抗HBV作用的效果。采用Taq man荧光定量PCR检测细胞上清HBV DNA，ELISA检测培养上清液HBsAg、HBeAg水平的变化。采用MTT法观察它们对细胞生长的影响。结果 大黄素的3个剂量组(12.5、25.0、50.0mg/L)和所观察的时间点(3、6、9d)对HBV DNA、HBsAg、HBeAg表现出剂量与时间依赖的抑制作用(P<0.05)。大黄素对HBV DNA抑制的半数抑制浓度为21mg/L，对HepG2.2.15细胞半数细胞毒性浓度为40.66mg/L，指数为1.94。同时发现黄芪多糖各剂量组对HBV无明显的抑制作用(P>0.05)。大黄素、黄芪多糖联合应用在疗效方面无明显的交互作用(P>0.05)。结论 大黄素在体外对HBV具有一定的抑制作用，黄芪多糖无明显抑制HBV的作用，两药联用无明显协同抗HBV的作用。

【关键词】  大黄素；黄芪多糖；乙型肝炎病毒；细胞培养

　　Inhibition on hepatitis B virus by emodin　and astragalus polysaccharides in vitro

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the effects of emodin, astragalus polysaccharides (APS) on hepatitis B virus (HBV) in vitro. Methods  Human hepatoma G2.2.15 cell line stably expressed hepatitis B virus particles in culture. The cells were exposed to different concentrations of emodin, APS, interferon α, and lamivudin, respectively. Real?time PCR was applied to quantify extracellular HBV DNA and ELISA was applied to assess HBsAg and HBeAg. MTT assay was used to evaluate the cytotoxicity of drugs. Results  The results showed that exposure of HepG2.2.15 cells to emodin resulted in a time? and concentration?dependent inhibition of HBV DNA replication and HBsAg, HBeAg secretion (P<0.05). IC50 to HBV DNA was 21mg/L, CC50 to HepG2.2.15 cells was 40.66mg/L, and the treatment index (TI) was 1.94. APS could not restrain HBV DNA, HBsAg and HBeAg obviously in vitro (P>0.05). The interaction was not significant between emodin and APS (P>0.05). Conclusion  Emodin had time? and concentration?dependent inhibitory effects to HBV in vitro in some extent; APS could not inhibit HBV obviously in vitro; Co?administration of emodin and APS had not significant interaction in restraining HBV in vitro.

　　KEY WORDS: emodin; astragalus polysaccharides; hepatitis B virus; cell culture

　　病毒性乙型肝炎的治疗关键是抗病毒治疗。中药在肝病治疗中起着很重要的作用。大黄和黄芪是治疗乙肝复方中最常用到的两味中药。近年来，研究证明它们对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)有一定的治疗作用。大黄素(emodin)是中药大黄的主要有效单体，黄芪多糖(astragalus polysaccharides, APS)是黄芪的主要有效成分。本研究以HepG2.2.15细胞为体外HBV复制模型，初步观察大黄素、黄芪多糖单独及联合应用对HBV的抑制作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  药物  大黄素(纯度950g/L购自西安崇信天然添加剂有限公司，由国家中药鉴定所鉴定，批文号：25100806)，黄芪多糖(纯度为600g/L，西安鸿生生物技术有限公司生产，国家中药鉴定所鉴定，批号：040618)，干扰素α(购自罗氏公司，批号：010801?I)，拉米夫定(3TC)0.1mmol/L的母液，由西安大学药学院提供。

　　1.2  试剂及主要仪器  噻唑蓝(MTT，Sigma)，二甲基亚砜(DMSO, Sigma)，HBsAg和HBeAg的ELESA检测试剂盒(上海华泰生物工程公司)，HBV DNA提取及扩增荧光检测试剂盒(广州中山大学达安基因股份有限公司)，和PE7700型自动荧光PCR仪(美国Perkin Elmer公司)。

　　1.3  细胞  HepG2.2.15细胞由第四军医大学唐都全军感染病诊疗中心惠赠，可稳定表达乙肝病毒蛋白并分泌病毒颗粒。培养液为DMEM(Gibco)，含200mL/L胎牛血清(杭州四季青生物材料公司)、0.3g/L谷氨酰胺(Gibco)，1×105u/L青链霉素(华北制药厂)，碳酸氢钠调整pH值到7.2。消化细胞用2.5g/L胰蛋白酶(Gibco)。

　　1.4  细胞培养  2.5g/L胰蛋白酶消化细胞，以1×104个/孔接种于96孔板，每孔200μL，于37℃、50mL/L CO2培养箱培养24h，待细胞贴壁后，换培养液进行实验。

　　1.5  实验分组  实验共分3大组，17个剂量组，分组如下：阳性对照组分别为干扰素(INFα)、拉米夫定，各设3个剂量组(125000、250000、500000u/L INF α；0.025、0.05、0.1μmol/L 3TC)；实验组为3个组，即大黄素组(12.5、25.0、50.0mg/L)，黄芪多糖组(120、240、480g/L)，联合用药组(25.0mg/L大黄素＋120g/L黄芪多糖，50.0mg/L大黄素＋120g/L黄芪多糖，25.0mg/L大黄素＋240g/L黄芪多糖，50.0mg/L大黄素＋240g/L黄芪多糖)；阴性对照组即生理盐水组，用等体积生理盐水加入。实验中除阴性对照组设10个复孔外，其余每个剂量组设5个复孔，用含药物培养液进行干预培养。每3d换同样浓度含药培养液及对照培养液1次。各孔在3、6、9d时，将吸去的上清液置于-20℃冰箱保存待检。

　　1.6  MTT实验  加药第9天吸去上清，每孔加5g/L的MTT 20μL，37℃培养4h，弃上清后，每孔加入150μL DMSO，震荡10min，测定570nm吸光度。按下列公式细胞的抑制百分率。

　　细胞抑制百分率=阴性对照组平均A值-实验组平均A值阴性对照组平均A值×100%按下列公式计算药物的半数细胞毒性浓度(CC50)。

　　CC50= lg-1B+0.5-<50%抑制百分率>50%抑制百分率-<50%抑制百分率×C    (B=lg<50%药物浓度，C=lg2)

　　1.7  荧光定量PCR法检测细胞外HBV DNA[1]   按照达安基因股份有限公司HBV核酸提取与核酸扩增荧光检测试剂盒说明书操作。两引物序列分别为P15′ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT3′，P25′ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA3′，荧光探针序列为5′TGGCTAGTTTACTAGTGCCA?TTTG3′。
各反应管放入PE7700自动荧光PCR仪，按下列条件扩增：93℃ 2min预变性，然后93℃ 45s到55℃ 1min循环扩增10个循环，再按93℃ 30s到55℃ 45s循环扩增，共30个循环。反应结束后由计算机自动分析出HBV DNA定量结果。按照下面公式计算药物对HBV DNA的抑制率。
   
　　HBV DNA抑制率=阴性对照组HBV DNA拷贝数-实验组HBV DNA拷贝数阴性对照组HBV DNA拷贝数×100%    按下列公式计算药物的半数抑制浓度(IC50)。
 
　　IC50=lg-1B+0.5-<50%抑制百分率>50%抑制百分率-<50%抑制百分率×C
   
　　(B= lg <50%药物浓度，C=lg 稀释倍数的倒数)
   
　　治疗指数(TI)= CC50/IC50。

　　1.8  HBsAg和HBeAg的测定  使用双抗体加心ELESA法[1]。根据试剂盒说明测定培养上清液的HBsAg和HBeAg，记录P/N值，按照下面公式计算药物对HBV DNA的抑制率。

　　HBsAg(HBeAg)抑制率=对照组P/N值-药物组P/N值对照组P/N值-2.1×100%

　　1.9  统计学处理  计量资料用均数±标准差表示，应用SPSS11.0软件进行方差分析检验，Student?Newman?Keuls进行不同组之间的两两比较。采用析因分析观察两种药物的交互作用，检验水准α=0.05。

　　2  结果

　　2.1  细胞毒性的测定  用药第9天，MTT实验结果显示12.5mg/L大黄素无明显毒性作用，25.0、50.0mg/L大黄素对细胞生长抑制率分别为29.6%、58.67%，其CC50为40.66mg/L。黄芪多糖各组与阴性对照组比较均未见到抑制细胞生长的作用(P>0.05)。大黄素与黄芪多糖联用无明显增加细胞毒性的协同作用(P>0.05)。各浓度拉米夫丁与较低浓度干扰素α也无明显细胞毒性作用，仅500000u/L干扰素α组抑制率达到48.1%，有统计学差异(P<0.05)。

　　2.2  药物对HepG2.2.15细胞培养上清的HBV DNA的抑制作用  药物作用第3天，大黄素25、50mg/L组平均HBV DNA的抑制率分别仅9.69%和35.59%，12.5mg/L组与阴性对照组间无明显差异(P>0.05)。作用第6天大黄素的抑制作用逐渐增强。作用至第9天，12.5、25、50mg/L大黄素平均HBV DNA的抑制率已经分别达到了21.21%、54.33%和68.65%，与阴性对照组相比，均表现出抑制HBV病毒核酸复制的作用(表1)。方差分析表明，大黄素对HBV DNA的抑制效果随作用时间延长而增强(P<0.001)，随剂量加大也逐渐增强(P<0.001)，呈明显的作用时间依赖性和剂量依赖性。根据公式计算，大黄素IC50为0.21mg/L，指数(TI)为1.94。
   
　　黄芪多糖不同质量浓度、不同作用时间均与阴性对照组HBV DNA无明显差异(P>0.05)。析因分析表明，黄芪多糖与大黄素两种药物联用，对HepG2.2.15细胞HBV DNA复制的抑制没有明显协同作用(P=0.607)。
   
　　干扰素α在体外对HepG2.2.15细胞HBV DNA复制也具有一定的作用，其IC50为499000u/L。拉米夫定表现出了很好的抗HBV DNA的复制作用，0.1μmol/L 3TC作用9d平均HBV DNA的抑制率达到70.93%，计算拉米夫定对细胞HBV DNA的复制的IC50为0.06μmol/L(表1)。

　　表1  实验药物对HBV DNA体外复制的抑制作用（略）

　　Table 1  Inhibitory effect of drug from HepG2.2.15 culture medium on hepatitis B virus replication

　　P<0.05 vs. negative control

　　2.3  大黄素对细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用  见表2。各质量浓度组大黄素随作用时间延长，抑制作用逐渐增强，治疗第9天达最高，与阴性对照组有明显差异(P<0.05)，而且高浓度大黄素作用更强(P<0.05)。黄芪多糖未见明显抑制乙型肝炎病毒抗原的分泌作用。大黄素、黄芪多糖联用对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg不具有协同抑制作用(P=0.095)。干扰素α对HBsAg、HBeAg分泌有较弱的抑制作用。拉米夫定对2.2.15细胞分泌HBsAg无明显的抑制作用。

　　表2  实验药物体外对HBsAg(HBeAg)分泌的抑制作用（略）

　　Table 2  Inhibitory effect of drug from HepG2.2.15 culture medium on HBsAg and HBeAg secretion

　　P<0.05 vs. negative control

　　3  讨论
   
　　HepG2.2.15细胞株是由含两个头尾相连的adw型HBV全基因质粒转染人肝肿瘤细胞株构建而成，体外培养能持续较高水平表达HBsAg、HBeAg和有生物活性的病毒颗粒[2]，目前，已成为公认的体外抗乙肝药物研究的主要工具。本实验选择HepG2.2.15细胞株作为体外HBV复制模型，初步观察大黄素、黄芪多糖抗HBV的作用。
   
　　中药大黄味苦寒，有泻实热、破积、解毒、消瘀的功效。研究证实大黄对多种细菌、病毒、螺旋体、支原体和原虫等病原微生物都有一定的抑制作用。大黄素是大黄的主要成分，已证实对人单纯疱疹病毒(Ⅰ型和Ⅱ型)、副流感病毒、牛痘病毒、柯萨基B组病毒等多种病毒具有抑制作用。本研究发现，大黄素在体外对于HBV的DNA复制、HBsAg和HBeAg的分泌均具有一定抑制作用。这种抑制在本实验所观察剂量范围内表现为剂量与时间依赖性抑制作用。上述实验结果提示大黄素可能除直接作用于HBV核酸水平外，也很可能干扰了HBV蛋白质合成及后加工等过程而发挥抗HBV的作用。这与氧化苦参碱的抗HBV结果相似[3]，推测大黄素与其他中药一样，从多靶点、多环节发挥作用。大黄素为脂溶性药物[4]，易于穿过细胞膜对细胞产生影响。我们推测大黄素应用于临床后不仅可能对血液、体液的病毒有抑制作用，而且由于其易进入肝细胞内，所以对肝内的病毒也可能具有较好的抑制效果。大黄素对HBV DNA的抑制IC50为21mg/L，对HepG2.2.15细胞CC50为40.66mg/L，计算治疗指数(TI)为1.94。我们将对其安全性做进一步的研究。
   
　　黄芪多糖是中药黄芪的主要有效成分，具有增强免疫、抗损伤等多种生物活性[5?6]。本实验结果发现，黄芪多糖在体外对HepG2.2.15细胞株的乙型肝炎病毒HBV DNA复制、HBsAg和HBeAg表达均无明显抑制作用，且与大黄素联合应用对HBV的抑制无明显的增强作用。分析其原因可能是黄芪多糖的作用效果主要通过在体内调节人体免疫、减轻肝损伤而发挥作用。因而，在体外单一细胞培养中未能发挥其作用。实验对照的阳性药物干扰素α和拉米夫定对HepG2.2.15细胞HBV的抑制作用与其他报道相近[7]。
   
　　本研究为中药有效成分抗HBV提供了实验资料。但是，也应注意体外研究的HBV是整合在HepG2细胞染色体上，复制方式与感染不同，不能被清除；而且细胞孤立于体外，脱离了体内免疫系统等对HBV的影响，与活体内情况不完全一致。因此，应该充分认识到本实验结果的局限性，进一步行体内实验，更深入地探讨大黄素、黄芪多糖抑制HBV的机制。

【】
  　　[1]党双锁. 医学常用实验技术精编 [M]. 西安：世界图书出版社, 2004:152.

　　[2]Sells MA, Zelent AZ, Shvartsman M, et al. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions [J]. J Virol, 1988, 62(8):2836?2844.

　　[3]李继强，陈萦晅，曾民德，等. 氧化苦参碱抗乙型肝炎病毒的体外实验研究 [J]. 中华消化杂志, 2001, 21(9):550?555.

　　[4]Alves DS, Perez FL, Estepa A, et al. Membrane?related effects underlying the biological activity of the anthraquinones emodin and barbaloin [J]. Biochem Pharmacol, 2004, 68(3):549?561.

　　[5]党双锁，张正国，袁利超，等. 大黄素和黄芪多糖对大鼠实验性肝癌的抑制作用 [J]. 西安大学学报( 医学版), 2006, 27(3):251?253.

　　[6]陈清江，杨丽，王辉，等. 黄芪对人肾间质成纤维细胞增殖和转化生长因子?β1表达的影响 [J]. 郑州大学学报(医学版), 2005, 40(5):871?873.

　　[7]Iyer RP, Jin Y, Roland A, et al. Phosphorothioate di? and trinucleotides as a novel class of anti?hepatitis B virus agents [J]. Antimicrob Agents and Chemother, 2004, 48(6):2199?2205.