多波长单因变量偏最小二回归校正法在他莫昔芬高效液相定量分析中的应用

【摘要】  　　使用偏最小二回归校正法处理他莫昔芬高效液相定量分析数据得到他莫昔芬的多波长标准方程，并将其与传统的单波长标准方程进行比较。结果显示多波长标准方程的平方相关系数大于单波长标准方程的平方相关系数，而多波长标准方程预测标准误小于单波长标准方程。

【关键词】  高效液相　多波长　偏最小二回归　标准方程

　　Application of Partial Least Squares Regression Method to HPLC Data of Tomaxi

　　Abstract  In this study, the HPLC multiwavelength data of tamoxifen was processed by using partial least squares regression method, and the calibration equation was aquired. Then it was comapared with the traditional single wavelength calibration equation, results showed that correlation coefficient of multiwavelength equation is more than single wavelength equation's, but the standard errors of prediction are less.

    Key words   HPLC;  multiwavelength;   partial least squares regression;   calibration equation

　　作为20世纪70年代以来最为迅速和应用最为广泛的分离分析技术之一，高效液相色谱法已被广泛地应用在有机、高分子、生物大分子和药物的定性与定量分析中［1］ ，它具有高准确度、高灵敏性、重复性好的优点［2］。传统的高效液相定量方法使用选定单波长下测得的峰面积构建线性回归方程［3］，其校正方法的数学模型如下［4］：A=+e=b+k·C+e(1)

　　其中A是色谱峰面积或者色谱峰高度测量值，是色谱峰面积或者色谱峰高度真实值，e是色谱峰面积或者色谱峰高度的误差，b是截距，k是常数，C是待测物浓度测量值。这个模型假定测量的误差主要来源于色谱峰的测量误差e，而待测物浓度误差则假定可忽略不计。这种方法有两个不适之处：一是这种方法的校正目的是利用待测浓度来确定色谱峰面积或峰高,实际我们需要的是根据色谱峰面积和色谱峰高来测定待测物浓度;二是误差来源。色谱峰面积或者色谱峰高的误差主要受高效液相性能影响，而随着科技进步，高效液相越来越精密，因仪器性能引起的误差与容量瓶、称量天平、进样器等引起的浓度误差相比越来越小［5］。因此我们建议校正模型应更改为以下公式 ：
　　C=+fA=+e　=b+k·（2）

　　其中e、f分别是色谱峰面积或峰高测量值A和待测物浓度测量值C的误差，色谱峰面积或者色谱峰高度真实值，待测物浓度真实值。我们希望根据测量观测值找到一组截距b和常数k，使得色谱峰或者色谱峰高的误差e和浓度测量误差f均最小。

    使用单波长标准方程的另一缺点是要预先确定待测物的最大吸收波长，而在高效液相色谱条件下为了准确找到最大吸收波长往往会增加色谱法定量分析的工作量。此外在药物的体内药物分析中常常有未知的微量药物代谢产物，因其结构与待测物相似且结构未知，常常干扰待测物的测定。而同时使用多波长校正方法处理DAD检测器测得的数据，既可减少色谱法定量分析的工作量，又可因不同波长数据可能含有不同信息而获得更好的测定结果［5］。

    在我们的研究中分别使用偏最小二回归校正法和传统的单波长校正法处理DAD检测器在多波长和单波长下采集的他莫昔芬高效液相色谱法数据，并使用交互验证（cross validation）和验证集预测法检验标准方程，结果证明多波长偏最小二回归校正方法是一个很好的，可替代传统单波长校正法的高效液相定量分析校正方法。

　　1  原理

    在5个波长处测定不同浓度（C1×7）的标准溶液，得到一组色谱响应值（A5×7）。可用以下矩阵方程表示它们之间的关系：A1×1…A1×7　　A5×1…A5×7=k1×1　k5×1·［C1×1 … C1×7］（3）即  A6×6=k6×1·C1×6（4）

    可得到  k6×1=A6×6CT1×6［C1×6CT1×6］-1(5)

    对公式（3）变换可得到浓度的表达式：C1×6=k′1×6A6×6(6)其中k′1×6=［kT6×1k6×1］-1kT6×1 

　　上式表明浓度预测值可用不同波长处测得的色谱响应值的线性组合来表示。因此我们可以使用多波长校正方法来获得关于浓度与色谱响应值的回归方程。

    多波长校正方法的缺点是光谱强度在某些波长处往往成比例，会产生共线性问题［4］，因此我们采用了单因变量的偏最小二回归法选择波长。作为一个多元线性回归方法，偏最小二乘回归的数学模型如下：A=+e=TP+e  C=+f=UQ+f(7)式中T、U分别是色谱响应值矩阵A和浓度矩阵C的得分矩阵，P、Q分别是色谱响应值矩阵A和浓度矩阵C的载荷（主成分）矩阵，e、f是拟合A和C时引进的误差。

    偏最小二回归法步骤如下：

    ① 将T和U做线性回归  U=TB(8)

    ② 求出关联系数矩阵  B=TU(T′T)-1(9)

    ③ 使用校正方法选择主成分

    ④ 得到回归方程  C=AP-1BQ(10)

    显然，偏最小二回归法通过选择主成分去除了噪音并解决了共线性问题。

　　2  仪器

    Agilent 1100高效液相色谱仪（美国，Agilent公司）；精密pH计（上海精密仪器有限公司）。

　　3  药品与试剂

    他莫西芬标准品（河南省食品药品监督管理局）；甲醇（天津市四友生物医药技术有限公司）、三乙胺（天津市光复精细化工研究所）均为色谱纯，乙醇、冰醋酸为分析纯；实验用水为Mili?Q超纯水。

　　4  方法和结果

　　4.1  标准溶液的制备

    精密称取他莫昔芬适量置100mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得浓度为0.25、0.5、1、2、5、10、20ug/ml的溶液备用。

　　4.2  色谱条件

    流动相为甲醇：甲醇三乙胺混合液（84：16）（V/V），其中甲醇三乙胺混合液（甲醇：1%三乙胺50：50）用1mol/lNaOH调节pH至9.963，流速为1.0ml/min, 柱温为室温。色谱柱为Kromasil C18 (dp 5 μm ， 25 cm×4.6 mm ID), Scienhome（天津科美特科技有限公司）；检测器为二极管阵列检测器；检测波长为230nm、235nm、240nm、245nm、250nm；进样量为20μL；检测器灵敏度0.01AUFS。

　　4.3  标准曲线的绘制

    分别取不同浓度（0.25、0.5、1、2、5、10、20ug/ml）的标准品20μL进样。在不同波长（230nm，235nm，240nm，245nm，250nm）下测定色谱峰面积。色谱图见图1，浓度与色谱峰面积值见表1。表1  他莫昔芬浓度值与色谱峰面积值
药物浓度（略）

    所有数据均使用SAS9.0处理。使用传统的校正方法得到各波长下的单波长标准方程见表2。处理结果提示截距无显著意义（P>0.05），表2中的标准方程已对截距项进行校正。从表2中可知在250nm波长处标准方程最好。以下均使用250nm处的单波长标准方程。表2  单波长标准方程（略）表3  多波长标准方程（略）

    对表中的数据进行偏最小二回归处理得到多波长标准方程C=-0.0854776+0.00321799A230+0.00327782A235+0.0032326A240+0.00343746A245+0.0039244A250。

　　5  标准方程验证

　　5.1  交叉验证

    按照下述步骤预测标准误（Standard error of prediction，SEP）：

    ① 标准化处理表1的数据。

    ② 剔除第i组数据后，使用上述算法计算得到新的单波长标准方程和多波长标准方程。

    ③ 使用新标准方程计算被剔除数据的预测值i。

    ④ 重复上述步骤直到所有数据均被剔除一遍。

    ⑤ 使用公式11计算预测标准误。

    SEP=?71(Ci-i)27(11)

    结果见表4。表4  交叉验证结果 （略）

　　5.2  验证集预测法验证

    交叉验证能够有效地滤除内部因素例如仪器噪音、稀释误差的影响，但是对数据共线性的影响却无能为力［5］，因此我们还使用了验证集预测法检验标准方程。

    在相同条件下另外再制备不同浓度Ci(0.3，0.6，1.5，2.5，5.5，10.5，19μg/mL)的他莫昔芬标准液。在相同条件下进样并测得色谱峰面积，用以上标准方程A=51.35×C和C=-0.0856+0.0032A230+0.0033A235+0.0032A240+0.0034A245+0.0039A250。分别计算他莫昔芬的预测浓度值i。使用公式11计算预测标准误。结果见表5。表5  独立数据验证结果 （略）

　　6  结果与讨论

    结果显示多波长标准方程的平方相关系数（R2=0.9999）大于单波长标准方程的平方相关系数（R2=0.9995），而多波长标准方程的预测标准误（0.1743，0.1513）小于单波长标准方程（0.1949，0.1897）。

    目前，传统的单波长标准方程广泛地应用于高效液相定量分析中，但它不能给出色谱条件优化的信息。多波长标准方程不需要耗费大量的精力去寻找最优波长，却可以给出优化波长信息，而且与单波长标准方程相比它还能够减小测量误差，这些优点使得它可以作为高效液相定量分析的一种替代方法。

【】
  　　1 陈立仁,蒋生祥,刘霞,等. 高效液相色谱基础与实践. 第1版. 北京:出版社,2001.

　　2 安登魁. 药物分析. 第1版. 济南:济南出版社,1992.

　　3 李发美. 分析化学. 第5版. 北京:人民卫生出版社,2006.

　　4 许禄. 化学计量学. 第1版. 北京:科学出版社,2004.

　　5 Richard G, Brereton. Introduction to multivariate calibration in analytical chemistry. Analyst, 2000,125:2125～2154.