大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导失巢凋亡过程中半胱氨酸蛋白酶3的作用
作者：冯建军，杨述华，孙立，唐欣
【关键词】 骨髓间充质干细胞；,,Caspase
摘 要：［目的］探讨在体外诱导骨髓间充质干细胞失巢凋亡过程中半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）的作用。［方法］将体外培养的骨髓间充质干细胞随机分为3组：对照组、诱导凋亡组、抑制凋亡组。应用Caspase3活性检测试剂盒，荧光比色法和Western blotting法检测失巢凋亡中Caspase3活性的改变；借助流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞凋亡的变化。［结果］流式细胞术显示诱导凋亡组出现了明显的凋亡峰，凋亡率随诱导时间的延长而明显增加；其它两组的凋亡率较低且较稳定。Western blotting检测和Caspase3活性荧光检测显示，诱导凋亡组Caspase3的活性以及蛋白表达水平随诱导凋亡时间的延长而明显升高，且与细胞凋亡率相关，以后者更灵敏，其余两组活性无明显变化。［结论］Caspase3蛋白在诱导骨髓间充质干细胞失巢凋亡的过程中发挥着重要作用；抑制Caspase3的活性可以有效降低细胞失巢凋亡率。
关键词：骨髓间充质干细胞； Caspase3； 失巢凋亡
Abstract：［Objective］To investigate the significance of Caspase3 in anoikis induced by preventing mesenchymal stem cells（MSCs）from adherence in vitro［Method］The cultured MSCs were randomly divided into 3 groups:control group,induced group and Caspase3 inhibitor groupMSCs anoikis was detected by flow cytometryThe caspase3 activity was evaluated by Caspase3 Fluorometric Assay Kit and Western blotting［Result］The flow cytometry analysis showd that apoptosis peak was appeared significantly in the induced groupand increased dramaticly along with the apoptosis conditions going onThe apoptosis rate of the others were lower and stableWestern blotting and fluorometric assay showed the caspase3 expressive level or activity in induced group was the highest and was related with its apoptosis rateThe fluorometric assay technique was sensitive to the western blotting［Conclusion］Caspase3 plays a vital role in suspended culture induced anoikis of MSCs in vitroDecreasing the activity of caspase3 by Caspase3 Inhibitor can reduce the anoikis rate
Key words：Mesenchymal stem cells; Caspase3; Anoikis
骨髓间充质干细胞作为组织工程最有希望的种子细胞之一，越来越受到重视。体外培养的骨髓间充质干细胞呈贴壁生长特性，如果将它改变为悬浮状态，由胞外输入的存活信号通路就会中断，从而诱发失巢凋亡〔1、2〕。Caspase3（半胱氨酸蛋白酶3）是涉及细胞凋亡的重要蛋白酶，它的激活意味着细胞不可避免的发生凋亡〔3、4〕。本实验选用琼脂糖预先铺被培养皿的方法来阻止骨髓间充质干细胞贴壁〔5〕，诱导失巢凋亡，并应用Caspase3抑制剂（DEVDCHO）以探讨Caspase3骨髓间充质干细胞失巢凋亡中的作用。
1 材料与方法
11 材 料
低糖DMEM培养基、特优级胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国GIBCO公司；Caspase3抑制剂DEVDCHO：美国Clontech公司产品（购自上海吉泰科技有限公司）；Caspase3荧光检测试剂盒：BioVision产品（购自深圳达科为生物技术有限公司）；Caspase3多克隆抗体：美国Clontech公司产品（购自上海吉泰科技有限公司）；琼脂糖和其余试剂均为进口分装或国产分析纯。
12 方 法
121 骨髓间充质干细胞的分离和培养
取6～8周SD大鼠，平均体重150~200 g，雌雄不限。用断颈法处死。用75％酒精浸泡15 min后移入超净工作台中，剥离股骨和胫骨，冲洗、浸泡于无菌的PBS培养皿内，剪去骨两端，露出骨髓腔。用DMEM培养液冲洗骨髓腔，反复2次。将含有骨髓细胞的培养液1 500 r／min离心10 min，弃去上清，用含10％FBS的DMEM全培养基重悬并接种于2~3个50 ml细胞培养瓶中。在37 ℃，5％CO2的培养箱中培养。于接种培养约12 h时换液，弃去未贴壁细胞。以后隔天换液，连续3次后改为每周换液2次。每天观察细胞形态并作记录。原代培养的细胞铺满整个培养瓶底面约80％时，即可用025％胰酶将贴壁细胞消化分离（37℃，2～3 min），然后按1∶2比例进行传代接种培养，传代培养的细胞生长约75％融合，重复传代操作。
122 骨髓间充质干细胞的鉴定
倒置显微镜下逐日观察原代及传代细胞的生长情况和形态特征。收集第2代培养的细胞，用25％戊二醛于4℃下固定过夜；按标准SABC检测试剂盒说明进行免疫细胞化学实验，检测CD34、CD44、CD54、CD68、CD71抗原的表达。
123 实验及分组
1231 利用琼脂糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡组
使用DMEM培养液溶解低熔点琼脂糖制备成约10％的混悬液，高温消毒后不待其冷却，立即取约25 ml铺被无菌60 mm培养皿底壁及侧壁。消化、收集第2代骨髓间充质干细胞，将其浓度调整为1×105／ml，取2~3 ml植入实验培养皿，转入37℃、5％CO2的培养箱中培养。
1232 使用DEVDCHO抑制琼脂糖诱导所产生凋亡的抑制凋亡组
铺被琼脂糖的方法同调亡组。在植入等量细胞的同时加入DEVDCHO，混合均匀，使其终浓度成为50 μmol/L〔6〕，培养条件同上。
1233 正常贴壁对照组
取2~3 ml植入不作任何处理的无菌培养皿，如上培养。
1234 实验分为诱导凋亡2、6、12、24 h组
抑制凋亡2、6、12、24 h组；正常贴壁2、6、12、24 h组。
124 流式细胞仪碘化丙啶（PI）染色测定细胞活力
收集各实验组的细胞，制备成5×105／ml的活细胞悬液，终浓度为70％的乙醇固定过夜。离心、重悬2次以去除乙醇，加入PI染料，4℃避光放置30 min~1 h后上样检测。
125 应用Caspase3活性荧光检测试剂盒检测
Caspase3蛋白活性:按试剂盒说明书进行，激发波长400 nm，发散波长505 nm。Caspase3激活后，可切割底物液中的DEVDAFC并使AFC游离，未被切割的DEVDAFC发蓝光，而切割后游离的AFC发黄绿光，且可用荧光分光光度计在505nm检测。测定切割所产生的黄绿光的量可以表示Caspase3的活性。
126 Western blotting检测
Caspase3蛋白的表达：收集各实验组在相应时间点的细胞，裂解细胞提取蛋白。蛋白定量后，以总蛋白量20 μg/孔上样，电泳完毕将凝胶上的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。软件分析蛋白条带积分吸光度值（IA）。
127 统计学处理
所有数据均在SPSS 100软件进行统计学处理，组间采用t检验，P＜005。
2 结 果
21 常规相差显微镜下观察
诱导凋亡组和抑制凋亡组的细胞呈小圆形、悬浮状态，细胞间有相互黏附的现象。正常贴壁组，细胞长梭形、贴壁时间正常。
22 骨髓间充质干细胞的鉴定
经免疫细胞化学检测，细胞均表达CD44、CD54、CD71，阳性反应产物为蓝黑色；CD34、CD68染色均为阴性。可以说明所分离的细胞是纯化的骨髓间充质干细胞。
23 Caspase3活性测定
诱导凋亡组，Caspase3的活性随着诱导持续时间的延长而明显增加，由2 h的922上升到24 h的2274（P＜0001）；使用DEVDCHO的抑制凋亡组和对照组，Caspase3的活性维持在较低的水平（P＞005）；诱导凋亡组与其它两组比较，统计学具有显著性差异（P＜0001）：抑制凋亡组和对照组间无明显差异（图1）。
24 流式细胞仪测定细胞的凋亡
各组均有明确的凋亡峰出现。诱导凋亡组的细胞凋亡率随着诱导持续时间的延长而明显增加，与其它两组比较，统计学具有显著性差异（P＜0001）；抑制凋亡组和正常贴壁组，细胞凋亡率维持在较低的水平且无明显差异（图2）。
25 Western blotting检测Caspase3蛋白的表达
诱导凋亡组Caspase3蛋白的表达水平逐渐升高，12 h达高峰；抑制凋亡组Caspase3蛋白的表达水平略有升高；对照组其表达水平稳定（图3）。
3 讨 论
正常细胞需要与其他细胞或细胞外基质互相接触，才能相互传递生长和分裂的信号，所以细胞与细胞的识别和粘着、细胞与细胞外基质的相互作用不仅是组织分化的需要，也是信号转导的重要途径〔7、8〕。包括骨髓间充质干细胞在内的许多种细胞在体外培养时，必须与胞外基质黏附才能生长和增殖，这种现象称为锚定依赖，表现为贴壁生长状态。依赖锚定生长的细胞一旦与基质分离，就会使外界输入的存活信号流中断而诱发失巢凋亡〔9、10〕。Haunstetter等〔11〕认为Caspase家族的激活是细胞凋亡的一个关键现象。其中，Caspase3是细胞凋亡蛋白级联反应的必经之路，是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶，也是细胞凋亡的主要效应因子和最重要的凋亡执行者〔12〕。Caspase3特异性抑制剂DEVDCHO通过有效抑制Caspase3活性，可以起到保护细胞的作用，抑制细胞凋亡〔13~15〕。本实验利用预先铺被琼脂糖来阻止细胞贴壁而悬浮生长，诱导失巢凋亡，并根据荧光标记的Caspase3抑制剂能与Caspase3活性中心特异性共价结合的原理，直接检测Caspase3的激活，为细胞凋亡的发生提供最直接的证据〔16〕，同时在相应时间点检测Caspase3蛋白的表达量与凋亡率。结果显示，预先铺被的琼脂糖可以有效阻止细胞贴壁；随着悬浮生长时间的延长，Caspase3的活性、表达量以及细胞凋亡和死亡率也随之增加，并且Caspase3的活性、表达量与凋亡紧密关联，当其活性和量较低时，凋亡率较低，当其增高时，凋亡率明显增加；抑制凋亡组的研究结果显示，DEVDCHO不但可以有效抑制Caspase3的活性而且还可以减少其表达量，同时明显降低了失巢凋亡率；本实验从正反两方面进一步证明Caspase3在失巢凋亡中也同样发挥着重要的作用。针对Caspase3两种不同的研究方法而言，应用Caspase3活性荧光检测试剂盒检测Caspase3蛋白活性的灵敏度明显高于使用Western blot检测Caspase3蛋白表达的方法，前者早在诱发凋亡后2 h就检测到Caspase3的变化；而后者较明显的变化则出现在12 h。这一现象说明，在凋亡的发生和过程中，Caspase3首先是发生活性的改变，大约12 h左右才出现数量的显著增加，其量的变化明显滞后。另外，因为在收集对照组细胞时需要使用胰蛋白酶消化细胞，所以在理论上，本实验该组Caspase3的测定值可能应高于实际值。
图13组细胞Caspase3活性曲线 图23组细胞凋亡曲线 图3不同时间的Caspase3在各组的表达水平 总之，作者认为Caspase3在失巢凋亡中也同样发挥着重要的作用；而DEVDCHO通过有效抑制Caspase3的活性和表达，可以明显降低失巢凋亡率；通过铺被琼脂糖的物理方式来阻止凋亡细胞贴壁、诱导失巢凋亡是一种简单而有效的方法。本实验针对骨髓间充质干细胞在悬浮状态下发生的凋亡现象进行了初步研究，发现DEVDCHO能够有效抑制骨髓间充质干细胞的失巢凋亡，为进一步研究骨髓间充质干细胞的悬浮培养特性提供依据。
：
〔1〕 Frisch SM,Francis H.Disruption of epithelial cellmatrix interactions induces apoptosis［J］.Cell Biol,1994,124:619626.
〔2〕 Meredith JE,Jr,Schwartz MA.IntegrinsAdhesion,and apoptosis,Trends Cell Biol［J］.1997,7:146150.
〔3〕 Alnemri ES.Mammalian cell death proteases:a family of highly conserved aspartate specific cysteine proteases［J］.Cell Biochem,1997,64:3342.
〔4〕 Porter AG,Janicke RU.Emerging roles of Caspase3 in apoptosis［J］.Cell Death Differ,1999,6:99104.
〔5〕 Graham Jones,Joel Machado,Jr,et al.PTENindependent Induction of Caspasemediated cell death and reduced invasion by the focal adhesion targeting domain in Human Astrocytic Brain Tumors Which Highly Express Focal Adhesion Kinase［J］.Cancer Reserch,2001,61:56885691.
〔6〕 Kojo SJ,ElenitobaJohnson,Stephen D,et al.Involvement of multiple signaling pathways in follicular lymphoma transformation:p38mitogenactivated protein kinase as a target for therapy［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2003,（100）12:72597264.
〔7〕 Frisch S M,Ruoslahti E.Integrins and anoikis［J］.Curr Opin Cell Biol,1997,9:701706.
〔8〕 Lukashev ME,Werb Z.ECM signalling:orchestrating cell behaviour and misbehaviour［J］.Trends Cell Biol,1998,8:437441.
