关节软骨损伤细胞修复研究进展
作者： 高曙光，雷光华，李康华
【关键词】 关节软骨损伤
关节软骨损伤主要由创伤和各种疾病如骨关节炎、剥脱性骨软骨炎、骨坏死等引起，容易导致关节功能障碍。关节软骨损伤目前方法很多，包括微骨折、软骨下骨打孔术、骨膜和软骨膜移植、自体和异体软骨移植、组织工程软骨移植、细胞移植、基因治疗等方法，但效果各异。他们都旨在解决两个主要问题：（1）利用与关节软骨相似的组织或材料充填缺损；（2）促使修复组织和原先组织在形态上相似，在结构和功能上相近。
目前用于细胞移植的细胞主要有：（1）自体和异体软骨细胞；（2）间充质干细胞。
1 软骨细胞移植
软骨细胞具有分离、培养简单、同源性好的优点，原代单层培养的软骨细胞能表达Ⅱ型胶原和可聚蛋白多糖等特异性细胞外基质达数日至数周。异体软骨细胞移植由于存在免疫排斥问题，又有传播细菌和病毒的危险，目前研究相对较少，而自体软骨细胞移植（autocartilage transplantation,ACT）国内外研究已有10多年的。
11 ACT的应用研究
自体关节软骨细胞移植可避免免疫反应或者疾病传染的问题，但可以采取的细胞数目有限，如果可以在体外使细胞数目增殖，临床应用才会成为可能。1989年Grande等在家兔实验中尝试了培养的自体关节软骨细胞移植。1994年Brittberg等首次报道ACT的临床应用，其操作程序如下：（1）切取非负重关节面正常健康的关节软骨；（2）酶消化和培养增殖；（3）关节切开，清除关节软骨至健康软骨面；（4）将骨膜移植片缝合于缺损关节面上；（5）将培养好的软骨细胞注射于骨膜移植片下缺损区。在其27例患者中，16处在股骨髁，7处在髌骨，皆为局部深层缺损，经传统方法治疗无效，行ACT术后3 a膝关节功能良好或好者占16例，并且股骨髁部修复效果较髌骨部好。1996年Brittberg等对骨膜加ACT或不加ACT修复兔髌骨软骨缺损的效果做了比较研究，移植后前者87％的缺损被修复，后者只有31％。Peterson等〔1〕报道1987～1996年应用ACT治疗219例病人，术后优良率达75％以上，结果显示缺损处新生组织在组织学与机械力学特征上与透明软骨相似。同时有学者认为ACT治疗的临床疗效与缺损部位相关，据报道股骨髁部的软骨缺损ACT治疗疗效最好，髌骨和股骨滑车软骨损伤疗效最差。2000年Brittberg等对37例ACT术后患者的活检研究表明，15例患者的再生组织类似透明软骨，同时发现软骨细胞在缺损区因重力作用分布不均，部分植入的细胞经覆盖的骨膜边缘漏出。
12 ACT相关支架研究
单纯的细胞移植存在细胞固定不牢、细胞丢失、修复组织有限、愈合速度慢、容易钙化、远期疗效不确定等问题，因此具有生物相容性良好、生物可降解性、一定的三维结构的支架材料一度成为研究的热点。作为培养的支架材料目前应用较多的有胶原、凝胶、透明质酸、聚羟乙酸（PGA）、聚乳酸（PLLA或PDLLA）、聚乳酸／聚羟乙酸共聚物（PLGA或PGA／PLLA）等。
Benya等的实验发现体外培养的单层软骨细胞在植入三维立体系统如琼脂糖凝胶后会重新获得进一步分化的能力，在三维立体系统中培养的软骨细胞能很好的保持细胞表型。1998年Rahfoth等报道将软骨细胞包裹在琼脂糖凝胶中修复家兔关节软骨缺损，18个月后47％缺损区为透明样软骨组织修复，对照组只有少量的修复组织。2003年Lee等将种植在Ⅱ型胶原载体上的软骨细胞体外培养增殖后再植入犬软骨缺损区，15周后发现88％左右的缺损区为修复组织覆盖，并且透明软骨占42％左右，但其力学性能仍低于正常软骨细胞。
纤维蛋白作为天然细胞外基质成分，有较好介导细胞间信号传导及相互作用的性能，取材简单，制备方便，并可按植入物的要求对工程化组织进行塑形，韧性好，无免疫原性，但其降解速度快是目前面临的最大问题。张力等〔2〕在纤维蛋白胶中加入抑肽酶和氨甲环酸，使纤维蛋白胶降解速度与软骨细胞基质形成同步速度，用这种改良纤维蛋白胶软骨细胞复合物修复兔软骨缺损，结果显示修复组织细胞内的氨基多糖含量接近正常透明软骨。
早在1993年Freed等将软骨细胞移植于PLLA、PGA支架上进行体外培养体内移植研究，取得了一定的成效，但其还存在一些不足之处，如PGA的降解速度太快，降解产物酸度大，软骨细胞耐受性差，而PLLA降解太慢，与新生软骨再生速度不匹配，因此人们把两者按一定比例制成共聚物PLGA，以结合两者的优点。Kim等将软骨细胞移植于PLGA中，体外培养1周后移植入鼠皮下，12周后共聚物消失，待之为原来形状的透明软骨块，其组织学表现与正常软骨相似，但PLGA仍有亲水性差，对细胞吸附不够等缺点。于是有学者采用卵磷脂和多聚赖氨酸对PLGA进行包埋，实验结果表明，卵磷脂增加了其亲水性，多聚赖氨酸增加了其亲水性和对细胞吸附性。李忠等〔3〕将胶原凝胶包埋的软骨细胞接种于复合聚磷酸钙纤维／聚乳酸（CPPF／PLLA）支架体外培养3周后移植入兔关节软骨缺损，术后4周修复区为透明软骨组织填充，术后12周修复区透明软骨厚度与其周围软骨相当，软骨细胞数量较前减少，与正常软骨排列相似，修复后的关节面平整，与周围组织整合良好，软骨下板重建，修复组织与其下方骨质结合紧密。
目前还没有资料明确表明哪种载体最好。凝胶载体对于维持细胞表型较好，但生物降解性能差，难以与周围组织整合在一起；聚乳酸、聚乙醇酸等人工合成的高分子共聚物又存在不同程度的组织相容性问题；而生物相容性较好的天然聚合物透明质酸、胶原或纤维蛋白胶存在力学性能及加工成形等性能缺陷。因此支架材料的相容性、降解性以及如何发挥各种材料的优势制成复合材料仍将是研究的方向。
对于软骨缺损的修复，有些学者把修复方法结合起来应用，有些学者把各种方法的疗效作比较研究。Dorotka R等〔4〕实验研究发现在三维胶原基质接种的自体软骨细胞联合微骨折治疗关节软骨缺损，其更容易再生透明软骨样组织。Melamed E等〔5〕实验研究发现自体软骨细胞移植优于软骨移植来修复关节软骨缺损；Bentley G等〔6〕在100例患者中用ACT和骨软骨移植修复关节软骨缺损，发现前者效果更好，并对骨软骨移植在以后的关节软骨缺损修复中是否继续应用持怀疑态度。Haddo O等〔7〕在治疗31例骨关节软骨缺损的患者中，用软骨样膜固定软骨细胞修复软骨缺损，疗效满意，相对于使用骨膜固定，术后1 a关节镜观察未发现修复组织过度膨大的证据。
目前临床上对软骨损伤的一般治疗原则是急性软骨损伤面积＜2 cm2或慢性损伤无手术治疗史者，首选清理、钻空、微骨折、骨软骨移植，术后行物理治疗6个月，如效果不佳者再行ACI；而急性软骨损伤面积＞2 cm2或既往手术后效果不佳者，则直接行ACI。
2 间充质干细胞移植
虽然近年来自体软骨细胞移植修复软骨缺损取得了一定的成效，但其来源有限，这促使家将目光瞄准具有多向分化潜能的间充质干细胞，通过定向诱导其分化成软骨细胞，移植修复软骨缺损。间充质干细胞（MSCs）来源于骨髓、骨膜、滑膜和肌腱等处，具有多向分化潜能，根据诱导环境的不同可分化为软骨细胞、成骨细胞、肌肉、肌腱、脂肪、成纤维细胞等。其中骨髓来源的间充质干细胞，即骨髓基质干细胞BMSCs的临床应用有其独特的优势：简单的骨髓穿刺就可取材；不存在组织配型及免疫排斥问题；可在体外定向诱导后再植入患处；可不断增殖，是基因治疗的最好载体。
21 BMSCs的应用及相关支架研究
1998年间充质干细胞临床应用于修复肌腱和骨组织。2002年Wakitani等〔8〕首次报道间充质干细胞临床应用于修复软骨缺损，他们从12例骨性关节炎患者的骨髓穿刺液中分离纯化出自体骨髓间充质干细胞，体外扩增后与胶原凝胶结合，在行胫骨高位截骨手术的同时，移植到股骨内髁软骨缺损，并覆盖以自体骨膜，结果发现：术后6周，缺损处产生白色至粉红色的柔软组织，术后42周，修复组织呈白色，可见部分组织为透明软骨样组织，但临床症状没有显著改善。
近年来无机材料作为软骨细胞支架的研究也逐步展开。Guo X等〔9〕认为MSCs在体外增殖分化中，大量的细胞丢失并且细胞活力慢慢下降，将移植细胞接种于β磷酸三钙生物陶瓷上培养增殖，用培养的细胞修复直径8 mm、深达4 mm的羊关节软骨缺损，24周后发现缺损由类透明软骨样组织修复，并且修复组织与相邻的软骨连接良好。但无机材料尚存在着脆性大、精确塑型较为困难等问题，与韧性更好的合成或天然聚合物复合有可能予以改进。周晓中等〔10〕利用多聚乙醇酸羟基磷灰石复合体为支架的骨髓基质细胞修复兔关节软骨缺损，结果表明BMSCsPGAHA复合体植入后形成稳定的透明软骨样修复组织及软骨下骨。该组织与周围正常软骨及软骨下骨融合好，32周后软骨标本无明显退变，为今后组织工程修复软骨中复合材料的应用进行了新的尝试并提供了可能性，但对于修复组织的机械强度、长期转归等，还需进一步研究。李文辉等〔11〕将藻酸钙、体外扩增的自体BMSCs及IGFI+TGFβ复合材料注射于兔膝关节股骨内髁负重区的骨软骨缺损，发现修复区有正常透明软骨样组织形成，软骨下骨修复良好。
丝蛋白〔12〕支架与MSCs制备工程软骨也有应用研究，这种支架具有高空隙率、生物降解慢、结构完整等特征，特别适合用于组织工程软骨的制备，与一般的胶原支架相比，丝蛋白支架的培养细胞氨基葡聚糖（GAG）更高。孙康等〔13〕探讨骨髓基质细胞和天然可吸收材料几丁质复合移植修复关节软骨缺损的可行性，实验结果显示几丁质+MSCs组术后16周关节软骨缺损其修复组织表面与正常软骨完全相同，软骨及软骨下骨修复良好。
王立春等〔14〕实验观察纤维蛋白凝胶、Ⅰ型胶原凝胶、混合凝胶3种不同生物型细胞外基质用于组织工程修复兔关节软骨缺损，形态学及性能特征比较，结果显示纤维蛋白凝胶优于Ⅰ型胶原，与混合凝胶无显著差异。Redman SN等〔15〕认为当前使用MSCs作为工程软骨细胞并联合生物可降解支架修复关节软骨缺损可改善关节功能，但防止修复组织退变是进一步研究的重点。
22 BMSCs相关基因转染技术
MSCs增殖和分化中，多种细胞因子起调节作用，研究目前主要集中在转化生长因子β（TGFβ）、骨形态发生蛋白（BMP）、成纤维细胞生长因子（FGF）。大量研究表明，在培养环境中加入适当浓度的生长因子可以对细胞的生长起到调控作用。调节软骨细胞外基质的生物合成，影响细胞的生物学形态，但这些外源因子在体内不能长久发挥作用。于是有学者尝试将外源基因导入移植细胞内部以产生内源性生长因子，而对靶细胞产生持续的调节作用，称之为基因转染技术。
Mason等〔16〕成功将BMP7基因导入兔BMSCs中与聚乙醇酸支架复合，植入兔关节软骨缺损处，8～12周后全层软骨缺损得到完全或近似完全的修复，而未做基因转导的对照组效果差。郭晓东等〔17〕通过脂质体介导TGFβ1基因转染MSCs移植修复兔关节软骨缺损实验证实，转基因细胞可继续表达TGFβ1至少4周以上。新生的透明样软骨组织中细胞功能活跃，基质中主要是软骨特异性Ⅱ型胶原纤维；软骨下区术后2周即有活跃的新骨和血管生成，12~24周时已完全再生。结果表明骨膜源MSCs可作为关节软骨缺损基因治疗的受体细胞，使TGFβ1基因得到表达，而且TGFβ1基因转染除具有拮抗IL1对MSCs羟脯氨酸合成的抑制作用外，还可抑制基质金属蛋白酶3、肿瘤坏死因子及干扰素γ等创伤和骨关节炎的病理过程中引起关节软骨破坏的多种主要炎症介质的生物活性，从而克服了目前国外正在进行的以IL1受体拮抗剂（IL1Ra）基因转染只能拮抗IL1活性、作用单一的缺点。
另外，Tsuchiya等〔18〕用包含sox9 DNA基因的质粒转染BMSCs，sox9转染的BMSCsⅡ型胶原染色阳性。将转染的细胞用扩散盒装载修复直径2 mm的鼠软骨缺损，4周后可见大量组织生成，组织学检查爱尔新兰和Ⅱ型胶原染色阳性，证明细胞介导sox9基因可以作为治疗透明软骨缺损的新手段。Corsi等〔19〕研究用壳聚糖纳米颗粒作为非病毒基因转导系统，包裹ssgelDNA质粒转染BMSCs。研究表明此种材料对细胞无毒性作用，是一个比较好的非病毒基因传送材料。虽然多种基因转染技术已经在大量的研究中，但目前尚处于实验阶段。
间充质干细胞来源广泛，有学者研究显示滑膜来源的间充质干细胞软骨形成能力更强。如Sakaguchi Y等〔20〕，实验比较由骨髓、骨膜、滑膜、骨骼肌、脂肪组织来源的间充质干细胞软骨形成能力，发现滑膜来源的间充质干细胞软骨形成能力更强。SeroH等〔21〕报道来源于滑膜的MSCs能分化成软骨细胞，并认为其不仅在治疗炎症性关节疼痛疗效较好，而且能用于制备组织工程软骨。但De Bari C等〔22〕在大鼠软骨缺损模型中研究发现，来源于滑膜的MSCs在体内难以形成异位稳定软骨，认为评价来源于滑膜的MSCs表型的稳定是必要的。对于哪种组织来源的间充质干细胞软骨形成能力更强，目前还没有一致的看法。
也有学者比较各种移植细胞在关节软骨缺损修复中的作用。Yan Hui等〔23〕在兔实验研究中比较软骨细胞、骨髓基质细胞及成纤维细胞对全层关节软骨缺损的修复作用，发现软骨细胞、骨髓基质细胞移植修复软骨缺损明显优于成纤维细胞及对照组。骨髓基质细胞与软骨细胞移植组的修复结果无统计学差异，但骨髓基质细胞修复组织的细胞排列有序，软骨下骨重建良好，与周围组织融合密切，更接近正常软骨。但是12周时部分修复组织有纤维样退变，长期结果尚需进一步研究。Hui JH等〔24〕在动物实验中比较培养软骨细胞、MSCs、骨膜移植物、自体骨软骨移植修复软骨缺损，发现培养软骨细胞和MSCs修复效果较好，自体骨软骨移植修复其次，骨膜移植物修复相对差一些。
3 存在的问题和展望
近年来软骨细胞移植和骨髓基质干细胞（BMSC）移植取得了可喜的成绩，但仍然有许多问题有待解决，如：（1）形成的软骨组织力学性能差，容易退化。（2）聚合物支架的炎性反应、免疫原性和致癌性。（3）转基因细胞基因表达的调控及安全性。（4）修复的软骨组织内细胞分子学特性尚未完全清楚。为了解决上述问题，必须进一步探索一种简单易行、的分离和鉴定移植细胞的方法；进一步探索移植细胞的适宜的诱导条件；进一步阐明移植细胞间、细胞与基质间的复杂调控机理；进一步研究各种细胞调节因子的作用机理及临床效果；进一步改进细胞培养的载体和方法；进一步研制优质的基因载体材料和多种材料复合等。相信随着分子生物学、生物材料学、机及纳米生物技术的，软骨细胞移植和骨髓基质干细胞移植修复关节软骨缺损将具有广阔的应用前景。
：
〔1〕 Peterson L,Mines T,et al.Twoto 9year outcome after autologous chondrocyte transplantation of the knee［J］.J Clin Orthop,2000,374:212234.
〔2〕 张力，李奇,等.改良纤维蛋白胶软骨细胞复合物修复软骨缺损的实验研究［J］.临床解剖学杂志，2005，13（1）：58.
〔3〕 李忠，杨柳,等.胶原凝胶包埋软骨细胞复合聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸支架异体移植修复兔关节软骨缺损［J］.中华实验外科杂志，2005，22（3）：266268.
〔4〕 Dorotka R,Windberger U,et al.Repair of articular cartilage defects treated by microfracture and a threedimensional collagen matrix［J］.Biomaterials,2005,26（17）:36173629.
〔5〕 Melamed E,et al.Restoration of arthritic cartilage defects using autologous chondrocytes transplantation is superior to cartilagepastegraft in rabbits［J］.J Knee Surg,2004,17（1）:612.
〔6〕 Bentley G,Biant LC,et al.A prospective,randomised comparison of autologous chondrocyte implantation versus mosaicplasty for osteochondral defects in the knee［J］.J Bone Joint Surg Br,2003,85（2）:223230.
〔7〕 Haddo O,Mahroof S,et al.The use of chondrogide membrane in autoogous chondrocyte implantation［J］.Knee,2004,11（1）:5155.
〔8〕 Wakitani S,et al.Human autologous culture expanded bone marrow mesenchymal cell defects in osteoarthritic knees［J］.Osteoarthritis cartilage,2002,10（3）:199206.
〔9〕 Guo X,Wang C,et al.Repair of large articular cartilage defects with implants of autologous mesenchymal stem cells seeded into betatricalcium phosphate in a sheep model［J］.Tissue Eng,2004,10（11~12）:15181829.
〔10〕 周晓中，张文智,等.多聚乙醇酸羟基磷灰石复合体为支架的骨髓基质细胞修复兔关节软骨缺损［J］.中华创伤杂志，2005，21（8）：617619.
〔11〕 李文辉,等.可注射性藻酸钙凝胶修复整合兔膝关节骨软骨缺损实验研究［J］.中国矫形外科杂志，2005，5（13）：372375.
〔12〕 Meinel L,et al.Engineering cartilagelike tissue using human mesenchymal stem cells and silk protein scaffolds［J］.Biotechnol Bioeng,2004,88（3）:379391.
〔13〕 孙康，汤继文,等.骨髓基质细胞与几丁质复合移植修复关节软骨缺损的实验研究［J］.中国矫形外科杂志，2004，12（15）：11661168.
〔14〕 王立春，张旗涛,等.纤维蛋白凝胶基质材料用于组织工程修复兔关节软骨缺损与Ⅰ型胶原凝胶和混合凝胶性能特征的比较［J］.中国临床康复，2005，26（9）：116118.
〔15〕 Redman SN,Oldfield SF,Archer CW.Current strategies for articular cartilage repair［J］.Eur Cell Mater,2005,14,9:2332.
〔16〕 Mason JM,et al.Cartilage and bone regeneration using gene enhanced tissue engineering［J］.Clin Orthop,2000,379（Suppl）:171178.
〔17〕 郭晓东，杜靖远,等.转化生长因子基因β1转染间充质干细胞对关节软骨的保护作用［J］.中华老年医学杂志，2001，20（3）.
〔18〕 Tsuchiya H,et al.Chondrogenesis enhanced by overexpression of sox 9 gene in mouse bone marrowderived mesenchymal stem cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003,301（2）:338.
〔19〕 Corsi K,et al.Mesenchymal stem cells,M G63 and HEK293 transfection using chitosanDNA nanoparticles［J］.Biomaterials,2003,24（7）:12551262.
〔20〕 Sakaguchi Y,et al.Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues:superiority of synovium as a cell source［J］.Arthritis Rheum，2005,52（8）:25212529.
〔21〕 Sero H,Tanaka S,Seto H,et al.Relationship between gene transfer and cartilage tissue engineering［J］.Clin Calcium,2004,14（7）:7276.
〔22〕 De Bari C,Dell Accio F,Luyten FP.Failure of in vitrodifferentiated mesenchymal stem cells from the synovial membrane to form ectopic stable cartilage in vivo［J］.Arthritis Rheum，2004 ,50（1）:142150.
〔23〕 Yah Hui,et al.Repair of fullthickness articular cartilage defedts with different origins of cell in a rabbit mode［J］.Chin J sports med，2003,22（3）:234239.
〔24〕 Hui JH,Chen F,et al.Treatment of chondral lesions in advanced osteochondritis dissecans:a comparative study of the efficacy of chondrocytes,mesenchymal stem cells,periosteal graft,and mosaicplasty（osteochondral autograft）in animal models［J］.J Pediatr Orthop,2004,24（4）:427433.
