胰岛素样生长因子1对重症急性胰腺炎大鼠肺损伤细胞凋亡的影响

【摘要】  目的： 探讨细胞凋亡和bax,bcl?2基因表达在重症急性胰腺炎（SAP）肺损伤发病机制中的作用以及胰岛素样生长因子1(IGF?1)对SAP肺损伤细胞凋亡的影响. 方法： 将Wistar大鼠72只随机分为对照组、SAP组和IGF?1组，每组24只. 大鼠SAP模型采用50 g/L的牛磺胆酸钠自胆胰管注入建立，三组在建模后6,12,24 h各取8只测定血清淀粉酶、肺损伤病理评分；光镜和电镜下观察肺组织病理变化，细胞凋亡原位检测法测定肺组织内细胞凋亡，RT?PCR法测定肺组织bax mRNA，bcl?2 mRNA的表达. 结果： SAP组血清淀粉酶、肺损伤病理评分、细胞凋亡指数、bax mRNA和bcl?2 mRNA表达较对照组升高，透射电镜下肺组织内细胞凋亡明显增多；经IGF?1干预后，血清淀粉酶、肺组织内细胞凋亡指数及肺损伤病理评分较SAP组下降，bax mRNA表达下降，bcl?2 mRNA表达增强，透射电镜下见肺组织内细胞凋亡明显减少. 结论： 肺组织细胞凋亡及bax，bcl?2基因表达参与了SAP肺损伤发病机制，IGF?1可通过抑制肺组织细胞凋亡减轻肺损伤，其机制可能部分是通过调节凋亡相关基因bax,bcl?2的表达来实现的.

【关键词】  危重病；胰腺炎；肺/损伤；细胞凋亡；胰岛素样生长因子1

　　【Abstract】 AIM: To explore the roles of cell apoptosis and expression of bax and bcl?2 in lung tissue in the mechanism of lung injury induced by severe acute pancreatitis (SAP) and the effects of insulin?like growth factor?1(IGF?1) on cell apoptosis in lung tissue of rats with SAP. METHODS: Wistar rats were randomly divided into three groups: Control group (n=24), SAP group (n=24) and IGF?1 group (n=24). Every group was randomly divided into 3 time units (6,12,24 h), with 8 rats in each time unit. The models of SAP were established by retro?grade injection of 50 g/L sodium taurocholate solution into the bilio?pancrestic duct of rats. At the 6,12 and 24 h after establishment of models, serum amylase, histologic scoring of lung injury were determined. The lung tissue was taken for light and transmission electron microscopic observation. Cell apoptosis in lung tissue was determined by TUNEL method, the expressions of bax mRNA and bcl?2 mRNA were detected by RT?PCR. RESULTS: In the SAP group, serum amylase, histologic scoring of lung injury, apoptotic index, the expressions of bax mRNA and bcl?2 mRNA markedly increased. Apoptotic cells increased obviously under transmission electron microscope. As compared with SAP group at the same phase, serum amylase, histologic scoring of lung injury, apoptotic index, expressions of bax mRNA in IGF?1 group decreased significantl, while the expression of bcl?2 mRNA increased significantly. Apoptotic cells decreased obviously in transmission electron microscopic observation. CONCLUSION: The apoptosis and expression of bax and bcl?2 in lung tissue might be involved in pathogenesis of the lung injury induced by SAP. IGF?1 can alleviate the lung injury by inhibiting apoptosis of lung tissue cells, in which its effects on regulating the expression of bax and bcl?2 may play an important role.

　　【Keywords】 critical illness; pancreatitis; lung/injuries; apoptosis; insulin?like growth factor

　　0  引言
   
　　重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）病情凶险，死亡率高达20%～30%［1］，在1 wk内死亡者多由肺损伤所致，目前SAP肺损伤的发病机制仍不完全清楚. 胰岛素样生长因子1（insulin?like growth factor?1,IGF?1）是对机体生长发育起重要调节作用的单链多肽，近年来因发现其在细胞凋亡调控方面具有重要作用而备受关注. 我们通过SAP肺损伤大鼠模型，探讨细胞凋亡和bax，bcl?2基因表达在SAP肺损伤发病机制中的作用以及应用IGF?1干预后的影响.

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  成年Wistar大鼠72 只（清洁级），体质量（200±50） g,雌雄不限（兰州大学动物实验中心）；牛磺胆酸钠（Sigma公司）；胰岛素样生长因子?1（Biovision公司）；细胞凋亡原位检测试剂盒（Roche公司）；Trizol试剂、RT?PCR相关试剂及引物（大连宝生物公司）. 引物序列如下：bcl?2（目的片段296 bp）上游：CGGGCTGGGGATGACTTCTCT; 下游：GCATCCCAGCCTCCGTTATCC；bax（目的片段452 bp）上游：CAGGATCGAGCAGAGAGGATG；下游：GTGAGGACTCCAGCCACAAAG；β?actin（目的片段548 bp）上游：ATGGATGACGTATCGCTG；下游：ATGAGGTAGTTGTCAGGT.

　　1.2  方法
 
　　1.2.1  动物分组  将大鼠随机分为对照组、SAP组和IGF?1组，每组24只. 术前12 h禁食、不禁水. 用20 g/L戊巴比妥钠按0.025 mL/kg腹腔注射麻醉后常规备皮、消毒、铺巾，正中切口入腹. SAP组由胆胰管以0.1 mL/min匀速逆行注入50 g/L牛磺胆酸钠（0.01 mL/kg）后逐层关腹；对照组自胆胰管内逆行注入等剂量生理盐水后逐层关腹；IGF?1组造模同SAP组并于术前30 min及术后3 h按50 μg/kg分别皮下注射IGF?1.3组在造模后分别于6,12,24 h各取8只，右心室穿刺抽血，快速切取肺脏组织，测定各项指标.

　　1.2.2  血清淀粉酶测定  用全自动生化分析检测仪测定.

　　1.2.3  肺组织学检查  肺组织石蜡切片行HE染色，光镜观察.肺损伤病理评分［2］.

　　1.2.4  肺组织细胞凋亡测定  采用TUNEL法测定，操作按试剂盒说明进行. 同一切片高倍镜下取3 个不同视野, 分别凋亡细胞数和总细胞数,取3 次平均值计算凋亡指数. 凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%.

　　1.2.5  肺组织bax mRNA和bcl?2 mRNA测定  采用Trizol试剂提取组织总RNA, 在20 μL体系中用目的引物反转录合成cDNA，应用聚合酶链式反应(PCR) 进行扩增. bax,bcl?2和β?actin的退火温度分别为58,56,54℃，循环次数均为34次. 取10 μL PCR扩增产物在0.1 g/L琼脂糖凝胶上电泳. 在UVP成像系统中观察电泳条带，用Labworks 4.0软件进行吸光度扫描分析,以β?actin为内参照,bax mRNA和bcl?2 mRNA表达水平以PCR产物吸光度值/β?actin吸光度值的比值表示.

　　1.2.6  透射电镜检查  观察肺组织损伤的超微结构变化及肺组织细胞的凋亡.
   
　　统计学处理： 所有数据采用x±s表示,由SPSS10.0软件处理. 采用单因素方差分析后,行相同时段两组间LSD?t检验,有关数据作Pearson相关分析.

　　2.1  血清淀粉酶测定  SAP组各时点血清淀粉酶较对照组明显升高（P<0.01,表1）；IGF?1组各时点血清淀粉酶与SAP组比较明显下降（P<0.05）.

　　2.2  肺组织学检查  光镜下对照组未见明显病变；SAP组可见肺泡间隔水肿增宽，红细胞渗出，大量炎性细胞浸润，肺毛细血管充血、破裂，甚至肺实变和肺组织结构破坏；IGF?1组肺泡和间质病理改变较SAP组明显减轻. 肺损伤病理评分SAP组各时点显著高于IGF?1组和对照组（P<0.05,表1）.

　　2.3  肺组织细胞凋亡情况  对照组仅见极少量细胞凋亡；SAP组凋亡细胞明显增多，凋亡指数较对照组显著增高（P<0.01,表1），并随着病程延长而上升；IGF?1组各时点凋亡指数较SAP组明显下降（P<0.05）. 肺组织内细胞凋亡指数与肺损伤病理评分呈正相关（r=0.907, P<0.01）.

　　表1  大鼠血淀粉酶、肺湿重系数、肺损伤病理评分、凋亡指数值（略）

　　aP<0.05, bP<0.01 vs SAP. SAP: 重症急性胰腺炎; IGF?1: 胰岛素样生长因子1.

　　2.4  肺组织细胞bax mRNA和bcl?2 mRNA的表达  对照组bax mRNA和bcl?2 mRNA的表达均很弱；SAP组两基因mRNA的表达较对照组各时点均明显增强,bax mRNA表达随着病程延长而上升,bcl?2 mRNA表达则呈先上升后下降趋势,bcl?2 mRNA/bax mRNA比值较对照组各时点显著下降（P<0.01,图1?3,表2）,该比值也有随着病程延长而呈逐渐下降的趋势；IGF?1组各时点与SAP组比较,bax mRNA表达明显下调, bcl?2 mRNA表达明显上调,bcl?2 mRNA/bax mRNA比值上升（P<0.01）.

　　表2  大鼠肺脏细胞bcl?2 mRNA,bax mRNA和bcl?2 mRNA/bax mRNA值（略）

　　bP<0.01 vs SAP组. SAP: 重症急性胰腺炎; IGF?1: 胰岛素样生长因子1.

　　图1  bax RT?PCR产物电泳（略）

　　图2  bcl?2 RT?PCR产物电泳（略）

　　图3  β?actin RT?PCR产物电泳（略）

　　2.5  透射电镜观察  SAP组肺组织内凋亡细胞明显增多，凋亡的肺泡Ⅱ型上皮细胞微绒毛明显减少，嗜锇型板层小体数量减少，几乎全部呈排空状态，核浓缩边集（图4A），凋亡的Ⅰ型上皮细胞内有空泡形成；IGF?1组肺组织内凋亡细胞较SAP组明显减少，肺泡Ⅱ型上皮细胞微绒毛丰富，嗜锇型板层小体排空现象较前减少，小体内含物较前增多，核无浓缩边集（图4B），Ⅰ型上皮细胞胞膜完整，无空泡.

　　A： SAP组  TEM×15 000； B: IGF?1组  TEM×12 000.

　　图4  肺泡Ⅱ型上皮细胞（略）

　　3  讨论
   
　　近年来SAP肺损伤发病过程中细胞凋亡的作用日益受到重视.我们采用TUNEL法对大鼠肺组织细胞凋亡进行检测,结果发现SAP组大鼠中肺组织细胞凋亡数量明显增多，凋亡指数显著升高，并与肺损伤病理评分呈正相关，表明肺组织细胞凋亡参与了SAP肺损伤的发病机制［3-4］.bcl?2和bax均为bcl?2基因家族成员，其中bcl?2可通过抑制caspase?3激活和细胞色素C的释放抑制细胞凋亡，而bax可通过抑制bcl?2的作用促进细胞凋亡. bcl?2与bax调节细胞凋亡的作用不仅取决于自身表达的高低，而且还与bcl?2与bax的比值有关［5］. 我们的研究显示，SAP时肺组织bax基因表达显著升高，并随病程延长而上升，bcl?2表达则呈先上升后下降趋势，bcl?2/bax的比值明显下降，其比值于造模后24 h最低，肺凋亡指数和肺损伤病理评分显著升高，且峰值时间同bcl?2/bax比值最低时间一致. 提示bcl?2,bax基因表达的改变参与了SAP肺损伤. 现在的研究表明，IGF?1在多种细胞中可通过调控bcl?2家族各成员的表达水平和磷酸化水平来发挥其抗凋亡作用. 在葡萄糖和氧化剂诱导的人和鼠肾小球膜细胞凋亡中，IGF?1可通过升高bcl?2/bax的比值，阻止细胞色素C释放来抑制细胞凋亡［6］. 我们的实验发现，给予IGF?1干预后肺组织bcl?2基因表达较SAP组各时间点明显上调，而bax基因表达则明显下调，bcl?2/bax的比值显著上升，肺组织细胞凋亡指数和肺损伤病理评分显著下降，透射电镜下见肺组织内细胞凋亡明显减少. 因此我们认为，IGF?1可通过抑制肺组织细胞凋亡减轻肺损害程度，其机制可能部分是通过调节凋亡相关基因bcl?2和bax来实现的.

【】
  　［1］ Gerlach H. Risk management in patients with severe acute pancreatitis［J］. Crit Care, 2004, 8:430-432.

　　［2］ Hofbauer B, Saluja AK, Bhatia M, et al. Effect of recombinant phate lata activating factor dletylpndrolase on two models of experimental acute pancreatitis［J］. Grastroenterology, 1998,115(5):1238-1247.

　　［3］ 史学深，方施华，朱明德,等. 重症急性胰腺炎大鼠DDFA对肺损伤细胞凋亡及Bax，Bcl?2表达的影响［J］.第四军医大学学报，2006, 27(12):1093-1096.

　　［4］ Takeyama Y. Significance of apoptotic cell death in systemic complications with severe acute pamcreatitis［J］. Gastroenterology, 2005,1(40):1-10.

　　［5］ Zhang G, Matsumoto S, Hyon SH, et al. Polyphenol, an extract of green tea, increase culture recovery rates of isolatedislets from nonhuman primate pancreata and marginal grade human pancreasta［J］. Cell Transplant, 2004, 13(2):145-152.

　　［6］ Kang BP, Urbonas A, Baddoo A, et al. IGF?1 inhibits the Mitochondrial apoptosis program inmesangial cells exposed to high glucose［J］. Am J Physiol Renal Physiol, 2003, 285(5):1013-1024.