β?actin在无菌性前列腺炎大鼠模型中免疫抑制治疗前后的表达及意义

【摘要】  目的： 检测β?actin在大鼠慢性无菌性前列腺炎（nonbacterial chronic prostatitis，CAP）动物模型免疫抑制前后的表达，探讨其与慢性无菌性前列腺炎发病机制的相关性. 方法： 成年Sprague?Dawley大鼠40只，随机分成4组: 正常对照组(A)，单纯造模组(B)，造模后免疫抑制治疗组(C)，造模后安慰剂治疗组(D). 采用去势后苯甲酸雌二醇皮下注射30 d造模，成功复制出大鼠无菌性前列腺炎模型. 采用免疫组化SP法分别检测β?actin在各组中的表达,并对检测结果进行统计学分析. 结果： 单纯造模组β?actin表达明显减弱，与正常对照组相比有显著性差异（P<0.05）. 经过环孢素A免疫抑制治疗后β?actin表达明显恢复，与单纯造模组相比有显著性差异（P<0.05）. 而安慰剂治疗组β?actin表达几近消失，染色面积为（0.22±0.31）%，与环孢素A治疗组相比均有显著性差异（P<0.01）. 结论： β?actin作为紧密连接中的关键性调节因子，在慢性无菌性前列腺炎的发病过程中可能具有重要的调节作用.

【关键词】  前列腺炎；慢性病；肌动蛋白类；大鼠，Sprague?Dawley；血?前列腺屏障；环孢菌素

　
　　【Abstract】 AIM: To investigate the expression of β?actin in nonbacterial chronic prostatitis（CAP） model rats before and after immunosuppressive therapy, and to evaluate its correlation with CAP. METHODS: Forty healthy, adult, Sprague?Dawley rats weighed 180～220 g were randomly divided into 4 groups, with 10 in each group: normal control group(A), model group(B), immunosuppressive therapy group(C) and the placebo control group(D). The rats were castrated and received injection of estradiol benzoate (0.25 mg/kg·d, s.c.) for 30 days to prepare CAP models. Immunohistochemistry was used to examine the β?actin expression in each group. RESULTS: Compared with group A, the expression of β?actin in group B was significantly decreased （P<0.05）. Compared with group B, the expression of β?actin in group C was significantly increased （P<0.05）. Compared with group C, the expression of β?actin in group D was significantly decreased (P<0.01). CONCLUSION: As the critical regulatory factor of tight junction，β?actin plays an important role in the pathogenesis of nonbacterial chronic prostatitis.

　　【Keywords】 prostatitis； disease; actins； rats, Sprague?Dawley； blood?prostatae barrier； cyclosporine

　　0  引言
   
　　慢性前列腺炎（CP）是一种十分常见的疾病. 据报道人群中男性有慢性前列腺炎者占10%，泌尿外科门诊有25%的患者是因慢性前列腺炎而就诊；其中90%左右为慢性无菌性前列腺炎（CAP）［1-2］. CAP主要发生于中青年男性人群,这是一组临床症候群，表现为尿频、尿急、尿痛、排尿不尽、排尿困难等排尿异常症状，会阴部、下腹部、阴茎阴囊、腰骶部等部位不适或疼痛等有各种独特形式的综合征. 已有研究表明免疫反应参与了CAP的发病机制［3］. 近来，随着免疫学和分子生物学的，许多学者开始研究免疫反应与前列腺炎发病的关系，从而探讨前列腺炎的病因、病理过程. 本研究采用免疫组织化学的方法检测β?actin在大鼠CAP动物模型免疫抑制治疗前后的表达，以探讨β?actin与CAP发病机制的相关性.

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  β?actin单克隆抗体（克隆号AC?74）购自碧云天公司；山羊抗小鼠SP染色二抗试剂盒购自中衫公司. 6 mo雄性Sprague?Dawley大鼠40只，体质量180～200 g，由甘肃省中医学院动物实验中心提供，自由摄食进水，室温18℃～25℃. 普通饲料喂养.

　　1.2  方法

　　1.2.1  试验动物分组及药物干预  将40只大鼠，随机分成4组： 正常对照组(A)，单纯造模组(B)，造模后免疫抑制治疗组(C)，造模后安慰剂治疗组(D). 造模组大鼠参照［4］，在去势1 wk后，给予皮下注射苯甲酸雌二醇0.2 mg/(kg·d)，连续4 wk，B,C,D组分别随机抽取5只大鼠，行前列腺部分切除术，病理HE染色证实成功复制出大鼠无菌性前列腺炎模型. 免疫抑制治疗采用环孢素A 12.5 mg/(kg·d)灌胃3 wk的方法. 安慰剂治疗组采用甘油12.5 mg/(kg·d)灌胃的方法.

　　1.2.2  免疫组化  取各组大鼠前列腺背外侧叶组织，福尔马林固定，石蜡包埋，切片脱蜡至水.蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，微波抗原修复. 30 mL/L H2O2室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2 min×3次. 100 mL/L正常山羊血清封闭，室温孵育10 min. 倾去血清，滴加1∶400一抗，4℃过夜. PBS冲洗，2 min×3次. 滴加适当比例稀释的生物素标记山羊抗小鼠二抗（10 mL/L BSA?PBS稀释），37℃孵育30 min. PBS冲洗，2 min×3次. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10～30 min. PBS冲洗，2 min×3次. DAB显色.自来水充分冲洗，复染，脱水透明、封片.

　　1.2.3  图像分析  将β?actin的免疫组化片放在40倍物镜下，每张切片随机选取20个视野扫描，输入TECBIAS?6803真彩色生物医学图象分析系统.
   
　　统计学处理： 数据用x±s表示，采用SPSS11.5统计软件行非参数u检验.

　　2  结果

　　2.1  动物模型HE染色  单纯造模组血管充血扩张，间质疏松水肿，间质纤维组织增生，以大量淋巴细胞为主的炎细胞浸润，还可见中性粒细胞、浆细胞，偶见吞噬细胞，部分腺管内有炎细胞，部分腺上皮呈乳头状增生（图1A）. 呈慢性炎症表现，非细菌性前列腺炎大鼠模型制备成功. 造模后免疫抑制治疗组血管扩张，间质略有疏松，间质内偶见少量炎细胞浸润，腺上皮增生不明显，无腺上皮脱落坏死.较之单纯造模组，炎症明显减轻（图1B）.

　　2.2  各组动物β?actin的表达  β?actin主要表达于4组内膜的腺上皮细胞,在腺管的间质及血管内皮细胞中亦有表达（图2）. 正常大鼠前列腺背外侧叶腺管上皮β?actin强烈表达，染色面积为（2.0±0.5）％. 单纯造模组β?actin表达明显减弱，染色面积为（1.0±0.6）%，与正常大鼠相比有显著性差异（P<0.05）. 经过环孢素A免疫抑制后β?actin表达明显恢复，染色面积为（1.81±0.51）%，与单纯造模组相比有显著性差异（P<0.05），与正常大鼠组无显著性差异（P>0.05）. 而安慰剂治疗组β?actin表达几近消失，染色面积为（0.8±0.3）%，与环孢素A治疗组相比有显著性差异（P<0.01）.

　　A: 模型组CAP； B： 免疫抑制治疗组.

　　图1  大鼠前列腺  HE ×200（略）

　　A: 正常对照组； B: 单纯造模组； C: 环孢霉素A治疗组； D: 安慰剂治疗组.

　　图2  β?actin在前列腺组织中的表达  SP ×200（略）

　　3  讨论
   
　　在前列腺炎的研究过程中，“血?前列腺屏障”（blood?prostate barrier）的概念逐渐得到重视. 它不同于血?脑屏障，不是血液和前列腺之间的屏障，而是专指前列腺腺管上皮屏障，中又称“血?前列腺液屏障”. 前列腺腺管上皮具有选择通透性，血液和前列腺间质内的成分不能自由通过腺管上皮进入腺管. 而且这种选择性通透性不能被LPS诱导的前列腺间质炎症所改变；并且在LPS诱导间质出现明显炎症后，炎细胞并不能迁移入腺管内. 在前列腺炎的发病过程中，血?前列腺屏障的破坏据推测可能是引发ⅢB型CP向ⅢA型CP转化的一个关键步骤［5］. 相类似的实验证据是： 向大鼠前列腺腹侧叶单独注入二硝基苯磺酸盐（作为刺激剂）或乙醇（前列腺腺管粘膜破坏剂）都不能产生明显的前列腺组织学炎症，而合并注入此两种物质则可以产生明显炎症，结论是在粘膜完整性遭到破坏的前提下，刺激物可以诱导出明显的前列腺间质炎症［6］. 这些实验均高度提示在前列腺腺管上皮存在一个屏障，这个屏障有阻止炎症发生和蔓延的作用.
   
　　关于血?前列腺屏障的组成，目前尚未见文献报告. 我们推测，可能其最重要的组成成分是细胞间紧密连接(TJ). 紧密连接在人体内大多数“屏障”中都扮演着主要角色，比如血?脑屏障、血?睾屏障、肠粘膜上皮屏障等. 既然上述实验证实血?前列腺屏障是客观存在的，那么其主要组成结构很可能就是紧密连接. Actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要的骨架蛋白. 它被认为是在紧密连接中具有关键性调节作用的一个蛋白. 在血?脑屏障和肠粘膜上皮屏障的研究中，人们逐渐认识到actin是在紧密连接中具有关键性调节作用的一个蛋白，它的表达缺失可直接导致紧密连接（屏障）的破坏. 其他组成成分只是作为细胞骨架成分存在［7］. Actin受白三烯、缓激肽、γ干扰素、组织胺等细胞因子的调节而发生改变，并且这种改变是可逆性的，已有动物实验证实［8-9］.
   
　　我们的实验结果表明，在大鼠无菌性前列腺炎模型的造模和免疫治疗前后，前列腺腺管上皮actin的表达是伴随着炎症的出现而减弱、伴随着炎症的好转而恢复. 综合上述理论和实验依据，我们推测，actin作为紧密连接中的关键性调节因子，很可能在慢性无菌性前列腺炎的发病过程中通过可逆性调节血?前列腺屏障从而发挥关键性的调节作用.

【文献】
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　　［4］ 魏武然，张唯力，戴君勇. 大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型的建立［J］. 男科学杂志,2006:22-24.

　　［5］ Fulmer BR, Turner TT. A blood?prostate barrier restricts cell and molecular movement across the rat ventral prostate epithelium［J］. J Urol, 2000,163:1591-1594.

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