喘息康对支气管哮喘大鼠外周血浆IFN?γ，IL?5，Eos和Eotaxin的影响
【摘要】 目的： 研究喘息康对哮喘大鼠模型外周血清中干扰素?γ(IFN?γ),白细胞介素?5(IL?5),嗜酸性粒细胞(Eos)及嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)的影响，探讨其支气管哮喘的作用机制. 方法： 将40只大鼠随机分组为正常对照组,哮喘模型组,喘息康中药组,地塞米松西药组，每组10只. 采用卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏和雾化激发的方法建立大鼠支气管哮喘模型，然后以不同的方法对哮喘大鼠模型进行干预. 采用ELISA方法检测每只大鼠血清中IFN?γ,IL?5及Eotaxin水平，取血清进行Eos计数. 结果： 哮喘模型组与正常对照组相比，血清中IFN?γ水平降低(P<0.01),而IL?5,Eotaxin和Eos计数则升高(P<0.01),并且引喘潜伏期缩短(P<0.05)；喘息康中药组和地塞米松西药组与哮喘模型组相比，血清中IFN?γ水平高于哮喘模型组(P<0.05),而IL?5,Eotaxin和Eos计数则降低(P<0.05),并且引喘潜伏期延长(P<0.05). 结论： 喘息康可以通过促进哮喘大鼠体内干扰素?γ分泌和抑制IL?5表达，而降低支气管高反应性（BHR）；并可通过抑制Eotaxin的表达而减少嗜酸性粒细胞(EOS)在肺部的聚集和活化,从而减轻气道EOS浸润,使引喘潜伏期延长,从而达到治疗哮喘的目的.
【关键词】 喘息康；哮喘；干扰素Ⅱ型；白细胞介素?5；嗜酸细胞；嗜酸细胞活化趋化因子
【Abstract】 AIM： To investigate the effects of Chuanxikang decoction(a Chinese herbal medicine)on peripheral plasma levels of IFN?γ, IL?5, Eos and Eotaxin in bronchial asthma rats and to explore its mechanism in the treatment of bronchial asthma. METHODS： A total of 40 rats were randomly divided into 4 groups： normal control group, asthmatic model group, Chuanxikang decoction group, and dexamethasone group, with 10 rats in each group. The rat models of asthma were established through injecting ovalbumin(OVA) into the abdominal cavity and inhalation of atomization. The animals underwent different interventions. The effects of Chuanxikang decoction on plasma levels of IFN?γ, IL?5 and Eotaxin were detected by immunohistochemical technology and the number of Eos was also determined. RESULTS： Compared with the normal control group, the concentrations of IFN?γ in the serum was decreased significantly (P<0.01) and IL?5, Eotaxin and the number of Eos were increased significantly (P<0.01) in the asthmatic model group, and asthma?induced delitescence was also shortened obviously(P<0.05). Compared with the asthmatic model group, IFN?γ in the serum of the dexamethasone group and Chuanxikang decoction group was increased significantly(P<0.05), while IL, Eotaxin and the number of Eos of them were decreased significantly(P<0.05), and asthma?induced delitescence was prolonged obviously(P<0.05). CONCLUSION: Chuanxikang has therapeutic effect on bronchial asthma by increasing the level of IFN?γ and inhibiting the expression of IL?5 in the serum, which blocks the bronchial hyperreactivity(BHR); and by decreasing the aggregation and activation of eosinophils (EOS)in lung tissue through inhibiting the expression of Eotaxin, which may lead to the mitigation of EOS infiltration, so as to prolong the asthma?induced delitescence.
【Keywords】 chuanxikang; asthma; interferon typeⅡ; interleukin?5; eosinophils; eotaxin
0 引言
支气管哮喘是由多种炎症介质、炎症细胞和细胞因子参与的一种气道慢性炎症性疾病，大量研究表明Th亚群中Th1和Th2之间存在着交互调节的关系［1］，Th1和Th2失衡在支气管哮喘发病过程中具有重要作用，表现为Th1功能相对抑制，Th2功能相对亢进［2］,而IFN?γ,IL?5分别是Th1, Th2细胞的特征性细胞因子. 哮喘其炎症特征为嗜酸性粒细胞(EOS)在支气管组织内聚集和活化导致的可逆性气道阻塞、气道变应性炎症(AAI)和气道高反应性(BHR). 中医药在支气管哮喘的治疗方面历来有其独特的优势，喘息康来源自我院名老中医在古方基础上的经验方，由蜜麻黄、苦杏仁、射干、细辛等中药组成，具有温肺散寒，化痰平喘的功效. 药表明：喘息康能延长豚鼠哮喘的引喘潜伏期，对角叉菜胶致大鼠足肿胀有不同程度的抑制作用,并且该方在临床上显示出良好的疗效. 本次实验旨在观察IFN?γ, IL?5, Eos和Eotaxin在喘息康干预后表达水平的变化，来探讨其作用机理.
1 材料和方法
1.1 材料 40只雄性SD大鼠，体质量（180±20） g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供［许可证号： SCXK?(J)2003?0001］. 卵蛋白为美国Sigma公司产品（批号： 20069812）. 百日咳疫苗，北京生物制品研究所生产（批号： 20070415）. 氢氧化铝由沈阳化学试剂厂生产. 喘息康由蜜麻黄、苦杏仁、射干、细辛四味中药组成，按生药5.36 g/kg量给药，由吉林省中医药院药理所制备. 地塞米松片，天津药业集团新郑股份有限公司生产，生产批号070404. 大鼠IFN?γ ELISA试剂盒和IL?5 ELISA试剂盒，均购自深圳晶美生物工程有限公司. Eotaxin ELISA试剂盒，购自上海天呈科技有限公司. 仪器 PAR?超声雾化器为德国Kendro公司产品，MB?Ⅲ酶标检测仪(北京宾达英创科技有限公司).
1.2 方法
1.2.1 分组 将实验大鼠随机分为4组，每组10只： 正常对照组，哮喘模型组, 喘息康中药组和地塞米松西药组.
1.2.2 造模 （1）正常对照组(A组)： 第1 d采用生理盐水1 mL代替抗原给大鼠进行腹腔注射致敏，第15 d后用生理盐水雾化激发，在激发前2 h，生理盐水2 mL灌胃，每日1次，每次30 min，连续10 d；（2）哮喘模型组(B组)： 第1 d用1 mL造模液(含OVA100 mg, 氢氧化铝干粉100 mg和灭活百日咳杆菌6×109个)腹腔注射致敏，15 d后将大鼠置于自制雾化箱(30 cm×30 cm×30 cm)内用10 g/L OVA溶液超声雾化激发，在激发前2 h，生理盐水2 mL灌胃，1次/d，30 min/次，共10 d，以大鼠出现烦躁不安、呼吸加深、加快，点头呼吸，咳嗽，闻及哮鸣音，呈哮喘样、口周发绀、反应迟钝等表现为成功的动物模型；（3）喘息康中药组：在激发前2 h，喘息康中药2 mL(5.36 g生药/kg)灌胃，其余同哮喘模型组；（4）地塞米松治疗对照组：在激发前2 h，地塞米松2 mL(0.5 mg/kg) 灌胃.
1.2.3 指标检测 （1）检测方法：建模第25 d，每只大鼠腹腔注射0.2 mL肝素钠，摘除眼球取血约3 mL予抗凝管中，以2000 r/min离心5 min，取血浆待测细胞因子. 取少量全血涂片，用吉姆莎染色，作Eos计数. （2）IL?5,IFN?γ和Eotaxin的检测：按试剂盒说明进行，在抗IL?5单克隆抗体包被的酶标板上，加入标本及不同浓度的标准品(100 μL/孔)，室温(20～25℃)孵育120 min，洗板4次，加入酶标记的抗IL?5单克隆抗体(100 μL/孔)，室温孵育60 min，洗板4次，加底物工作液，避光室温10～30 min，加终止液，混匀，5 min内用酶标仪测光密度值，绘制标准曲线，查出标本浓度. IFN?γ和Eotaxin按ELISA试剂盒说明进行.
统计学处理： 实验数据采用统计软件SAS8.2进行统计学处理，计量数据以x±s表示. P<0.05即认为有统计学差异.
2 结果
喘息康对哮喘大鼠嗜酸性粒细胞计数和潜伏期有一定的影响(表1) . 与空白组比较，哮喘模型组血液中Eos的数量升高(P<0.01)；喘息康中药组(C组)和地塞米松西药组中Eos的数量升高(P<0.05). 与模型组比较： 喘息康中药组和地塞米松西药组中Eos的数量均降低(P<0.05). 各组大鼠在激发前一般状态良好. 激发后，正常对照组大鼠无明显变化. 哮喘模型组大鼠则出现烦躁不安、呼吸加深、加快，点头呼吸，咳嗽，闻及哮鸣音，呈哮喘样、口周发绀、反应迟钝等表现. 喘息康中药组和地塞米松西药组大鼠呼吸急促，呼吸节律不整，呼吸幅度增强等较模型组减轻，与模型组比较引喘潜伏期延长(P<0.05). 喘息康对哮喘大鼠IFN?γ，IL?5和Eotaxin表达有一定的影响（表2）. 哮喘模型组与正常对照组相比，前者血清中IFN?γ水平降低（P<0.01），而IL?5和Eotaxin则升高(P<0.01)；喘息康中药组和地塞米松西药组与模型组相比，血清中IFN?γ水平高于哮喘模型组(P<0.05),而IL?5和Eotaxin则降低(P<0.05).
表1 喘息康对哮喘大鼠血液中Eos计数和潜伏期的影响（略）
aP<0.05, bP<0.01 vs正常对照；cP<0.05 vs哮喘模型.
表2 喘息康对哮喘大鼠IFN?γ，IL?5和Eotaxin表达的影响（略）
aP<0.05, bP<0.01 vs正常对照； cP<0.05, dP<0.01 vs哮喘模型.
3 讨论
支气管哮喘是一种多种细胞和细胞因子参与的免疫失衡性的气道慢性炎症，T细胞及其分泌的各种因子在免疫过程中起关键的调控作用，表现为Th1型和Th2型细胞亚群失衡，即Th2型优势应答，这是哮喘病理过程形成的始动因素和维持因素［3］. Th2型细胞因子增高在哮喘发病机制中起着重要的作用［4］. Th1/Th2平衡理论作为支气管哮喘发病机制的核心已被大多数学者所接受.
在正常机体中，Th1和Th2的前体细胞为Th0，Th0按一定比例向Th1和Th2分化. Th1主要分泌IFN?γ,IL?2,IL?12；Th2主要分泌IL?4,IL?5,IL?6和IL?10. IFN?γ可促进Th0细胞分化为Th1细胞，抑制Th2细胞增殖，并且IFN?γ对气道嗜酸性粒细胞浸润具有抑制作用. IL?5是Th2细胞产生的一种细胞因子，可以增强EOS对血管内皮细胞的黏附能力，并对EOS具有强烈的趋化作用；IL?5还可以促使EOS的最终分化，延长其存活时间；IL?5在嗜酸性粒细胞分化、成活和募集至气道以及辅助B淋巴细胞产生抗体(IgE,IgA)等过程中起重要作用［5-6］. 吴银根等［7］采用ELISA法测定哮喘豚鼠外周血IL?5含量，结果发现中药咳喘落通过抑制免疫细胞产生IL?5，抑制IL?5对EOS的聚集和活化，从而发挥哮喘慢性气道炎症的免疫学调控作用.
目前，治疗哮喘最有效、最常用的依然是糖皮质激素，可以从多个环节抑制气道炎症，缓解病情；可作用于大多数炎症细胞和结构细胞，尤其是吸入糖皮质激素可下调气道上皮炎性基因表达［7-9］，激素可通过促进凋亡使组织及外周血中Eos迅速下降而抑制哮喘时的组织炎症，但它缺乏特异性，同时抑制Th1型和Th2型细胞功能，降低了机体的细胞免疫能力，并且易于并发病原微生物的感染. 中药在治疗支气管哮喘方面积累了相当丰富的经验，能多靶点、多环节调节整个机体的动态平衡，并且其毒性低，维持疗效时间长，相对于化学药物，中药的副作用相对较小，而且在哮喘潜伏期中药可以通过调整患者自身的抵抗能力从而达到减少哮喘的发作次数甚至可以起到治愈的目的.
本研究结果显示，与正常对照组相比，哮喘模型组血清中IFN?γ水平降低，IL?5和Eotaxin水平升高. 经药物干预后，喘息康能有效升高哮喘大鼠血清中IFN?γ水平，降低IL?5和Eotaxin水平，减少Th2型细胞因子的合成，恢复Th1/Th2细胞因子的平衡，进而抑制过度亢进的Th2型反应，通过调节免疫失衡而起到治疗哮喘的作用. 并通过抑制Eotaxin的表达而减少EOS在肺部的聚集和活化，从而减轻了气道EOS浸润性AAI及BHR，使引喘潜伏期延长. 其作用机制与医学观点相一致，这可能是喘息康治疗哮喘的机制之一.
【】
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