基质金属蛋白酶?14和细胞外基质金属蛋白酶诱导因子在视网膜母细胞瘤中的表达及意义

【摘要】  目的 探讨基质金属蛋白酶?14（matrix metalloproteinase?14,MMP?14）和细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN）在视网膜母细胞瘤（retinoblastoma, Rb）中的表达及其与临床病程的关系。方法 用免疫组织化学SP法分别检测39例Rb中MMP?14及EMMPRIN的表达；用LEICA IM 50型全自动医学图像分析系统测量其平均灰度值，比较不同临床和病理阶段Rb中表达MMP?14和EMMPRIN的差异及二者阳性表达之间的关系。结果 39例Rb中MMP?14阳性表达34例，占87.18%；EMMPRIN阳性表达33例，占84.62%；青光眼期Rb中MMP?14和EMMPRIN的表达明显高于眼内期（P＜0.01及P＜0.05），眼外期二者表达明显高于青光眼期（P＜0.01及P＜0.05）；视神经浸润组Rb中MMP?14和EMMPRIN的表达明显高于无视神经浸润组（P＜0.01及P＜0.05）；Rb中MMP?14和EMMPRIN的阳性表达水平呈密切相关（P＜0.01）。结论 MMP?14及EMMPRIN的表达水平可能与Rb的浸润转移有关，二者共同促进Rb的浸润转移。

【关键词】  视网膜母细胞瘤；基质金属蛋白酶?14；细胞外基质金属蛋白酶诱导因子；免疫组织化学

　
　　To investigate the expressions of matrix metalloproteinase?14 (MMP?14) and extra?cellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN) in retinoblastoma(Rb) and the relationships between MMP?14 and EMMPRIN and tumor development. Methods  Immunohistochemical technique was used to determine the expressions of MMP?14 and EMMPRIN in 39 cases of paraffin embedded Rb samples. Quantitative analysis of the expressions of MMP?14 and EMMPRIN were assessed by measuring the mean gray scale of Rb tissue with the LEICA IM 50 Color Pathologic Analysis System. Differences of the expressions of MMP?14 and EMMPRIN in each clinical and pathological stage were statistically analyzed, and the same step was also undertaken to study the relationship between Rb with MMP?14 positive expression and that with EMMPRIN positive expression. Results  Positive expression rate of MMP?14 was 87.18% (34/39) and of EMMPRIN was 84.62%(33/39). The expressions of MMP?14 and EMMPRIN were significantly higher in tumors of the glaucomatous stage than those in the intraocular stage (P＜0.01 and P＜0.05), and the same conclusion can be concluded between those in the extra?ocular stage and those in the glaucomatous stage (P＜0.01 and P＜0.05), also the expressions of MMP?14 and EMMPRIN were significantly higher in tumors with optic nerve invasion than those without optic nerve invasion (P＜0.01 and P＜0.05). There was a statistically significant positive correlation between the

　　视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,Rb）起源于视网膜胚胎性核层细胞，是一种婴幼儿最常见的、危害性最大的眼内恶性肿瘤，可危及患儿的视力甚至生命。通常认为，Rb患儿的预后与视神经浸润与否、有无眶内及远处转移有密切关系。近年来的研究显示基质金属蛋白酶?14（matrix metalloproteinase?14,MMP?14）以及细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extrace?llular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN）在促进肿瘤的侵袭转移中发挥着重要作用［1］。本研究运用免疫组织化学法检测了MMP?14和EMMPRIN在视网膜母细胞瘤中的表达，分析其与临床病程的关系，探讨其在肿瘤浸润转移中的意义。

　　1  资料与方法

　　1.1  病历资料

　　本实验所有石蜡包埋标本均来自山东省立眼科病理室自1988年～2005年间接受眼球摘除术的Rb患者，共39例，其中男16例，女23例。年龄3月～8岁，平均2.9岁。通过调阅病历及病理诊断书确定临床分期：眼内期22例，青光眼期11例，眼外扩展期6例，全身转移期0例；有视神经浸润18例，无视神经浸润21例；双眼发病1例。所有病例均经病理确诊。

　　1.2  主要试剂

　　兔抗人MMP?14单克隆抗体，工作浓度为1∶100；兔抗人EMMPRIN单克隆抗体，工作浓度为1∶100，即用型SABC免疫组化染色试剂盒（包括生物素化羊抗兔IgG二抗、DAB显色剂、SABC），中性树胶均购自武汉博士德公司。

　　1.3  实验方法

　　采用免疫组织化学法。具体步骤：石蜡标本行4?μm厚连续切片，脱蜡，梯度乙醇脱水，3%过氧化氢乙醇溶液孵育10?min,以灭活内源性过氧化氢酶,蒸馏水洗涤10?min；枸橼酸盐缓冲液内微波修复抗原，92?℃～98?℃,10?min，室温冷却，PBS洗涤3次；滴加5％BSA封闭液，室温20?min，不洗；滴加一抗（用PBS代替一抗为阴性对照），4?℃湿盒过夜，PBS洗涤3次；滴加二抗工作液，37?℃湿盒内孵育20?min，PBS洗涤3次；滴加试剂SABC，37?℃ 10?min，PBS洗涤4次；DAB显色,光镜下控制，观察染色结果满意后水洗终止,苏木素复染细胞核，二甲苯透明,梯度乙醇脱水。晾干后中性树胶封片。

　　1.4  观察方法

　　光学显微镜下观察，Rb切片组织中胞浆和/或胞膜上出现较多棕黄色颗粒为阳性表达，无棕黄色颗粒出现为阴性表达。并在LEICA IM 50型全自动医学图象分析系统的10×40倍光镜下测量每张切片Rb组织的灰度值，每张切片随机选取5个视野，算出其平均值为每张切片的灰度值。灰度值愈小其阳性表达水平愈高,反之则表达水平愈低。

　　1.5  统计学处理

　　结果采用SPSS 13.0统计软件包进行两样本t检验、方差分析、最小显著差检验以及Spearman等级相关检验。

　　2  结  果

　　2.1  MMP?14和EMMPRIN在Rb中的表达

　　39例Rb标本中，检测到MMP14阳性表达34例，表达率为87.18%（34/39）；EMMPRIN阳性表达33例，表达率为84.62%（33/39），二者皆表现为胞浆和/或胞膜呈现出棕黄色着色（图1、2）。经两样本t检验，MMP?14阳性组与阴性组中Rb组织的灰度值差异具有统计学意义（P＜0.01），EMMPRIN阳性组与阴性组中Rb组织的灰度值差异也具有统计学意义（P＜0.01），见表1（略）。图3为阴性对照。   

　　2.2  MMP?14和EMMPRIN在Rb有视神经浸润和无视神经浸润组中的表达

　　39例Rb标本中，有视神经浸润者18例（46.15%），无视神经浸润者21例（53.85%）。经两样本t检验，MMP?14在有视神经浸润组和无视神经浸润组中表达的灰度值差异具有统计学意义（P＜0.01），EMMPRIN在有视神经浸润组和无视神经浸润组中表达的灰度值差异也具有统计学意义（P＜0.05），见表2（略）。

　　2.3  MMP?14和EMMPRIN在Rb临床各期中的表达
 
　　39例Rb中，眼内期22例，青光眼期11例，眼外扩展期6例。经方差分析，认为MMP?14在眼内期、青光眼期及眼外扩展期表达水平不等或不全相等（F=18.572，P＜0.01），EMMPRIN在眼内期、青光眼期及眼外扩展期表达水平不等或不全相等（F=10.772，P＜0.01）。进一步经最小显著差检验进行各组间均数的两两比较发现，MMP?14或EMMPRIN在眼内期与青光眼期及眼外扩展期、青光眼期与眼外扩展期之间的表达差异具有统计学意义，见表3。

　

　2.4  MMP?14和EMMPRIN在Rb中表达水平的关系

　　对MMP?14和EMMPRIN在Rb中的表达水平进行Spearman等级相关分析，Rb组织中EMMPRIN与MMP?14的表达强度呈正相关关系(r=0.877, P＜0.01)。

　　3  讨  论  

         肿瘤侵袭和转移的基本过程是瘤细胞从原发瘤脱离后侵犯周围和(或)远处组织,涉及瘤细胞穿过细胞外基质(extracellular matrix,ECM)屏障、血管壁的基底膜,以及穿出血管壁进入宿主微环境的过程。ECM是肿瘤侵袭和转移的重要组织屏障。基质金属蛋白酶对基底膜中细胞外基质的降解是肿瘤浸润和转移的关键步骤之一。MMP?14作为基质金属蛋白酶家族（matrix metalloproteinases,MMPs）中的重要一员，不但是前体MMP?2(proMMP?2)的细胞表面激活因子,使之激活后具备了降解ECM的能力，而且可以直接赋予无侵袭潜能的细胞穿透I型胶原的能力,且此过程不依赖proMMP?2的激活［2］。同时，它还能够通过降解层粘连蛋白?5而暴露可以启动内皮细胞移动能力的关键序列，从而有利于肿瘤细胞的浸润转移［3］。EMMPRIN是由肿瘤细胞产生的一种跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族中的一员，可通过肿瘤细胞与肿瘤间质中成纤维细胞间的相互作用促进成纤维细胞分泌MMP?1、MMP?2和MMP?14,也可通过肿瘤细胞与肿瘤细胞间的相互作用促进肿瘤细胞分泌MMP?2，对ECM进行降解，促进肿瘤细胞的浸润转移［4］。同时，它也可以通过一种旁分泌的方式作用于血管内皮细胞，通过调节内皮细胞MMPs的产生而参与肿瘤新生血管生成［5?6］。此外，MMP?14和EMMPRIN还可以上调肿瘤中血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达水平，有利于肿瘤的血管新生，促进肿瘤的浸润转移［7?8］。本研究初步探讨了MMP?14和EMMPRIN在视网膜母细胞瘤中的表达及意义。

    本实验通过免疫组化研究显示,MMP?14和EMMPRIN在Rb组织中的阳性表达率分别为87.18%和84.62%，青光眼期Rb中MMP?14和EMMPRIN表达的灰度值明显低于眼内期（P＜0.01及P＜0.05），眼外期明显低于青光眼期（P＜0.01及P＜0.05），视神经浸润组中二者表达的灰度值明显低于无视神经浸润组（P＜0.01及P＜0.05），提示了MMP?14和EMMPRIN的高表达可能与Rb的侵袭转移能力增强及肿瘤的预后不良有关。Adithi等［9］运用免疫组化和免疫印记法对60例Rb进行检测，发现EMMPRIN的阳性表达率为64%，同时伴有MMP?2和MMP?9的高表达(66%和61%)以及TIMPs的低表达；在发生转移的Rb中EMMPRIN强阳性表达（3+）率为39%，而在未发生转移的病例中仅为3%，认为在Rb中EMMPRIN对MMP?2的表达具有上调作用，且二者在肿瘤的浸润转移中起着重要作用。其结果与本实验结果一致都发现了Rb中EMMPRIN 的高表达。在其它与Rb一样来源于神经外胚层的肿瘤中,发现MMP?14的变化与本实验结果类似。如在人脑胶质细胞瘤中高级别胶质瘤组织(Ⅲ～Ⅳ)中MMP?14和MMP?2的阳性表达率显著高于低级别胶质瘤组织(Ⅰ～Ⅱ), 在单因素生存分析中,MMP?14的表达与患者预后不良有关,提示MMP?14的表达水平与肿瘤的恶性程度及侵袭能力有关［10］。本实验结果还表明，尚有部分Rb病例不表达MMP?14或EMMPRIN，二者的阴性表达率分别为12.72%和15.38%，而其原因尚不清楚。
   
　　本实验通过对MMP?14和EMMPRIN在Rb中的表达水平进行比较显示，Rb组织中EMMPRIN与MMP?14的表达强度呈正相关关系（P＜0.01），提示二者可能在Rb的发生中同步升高，共同促进Rb的浸润转移。在其他肿瘤中也发现了MMP?14和EMMPRIN的高表达。如Nabeshima等［11］通过对周围神经鞘瘤的研究发现，MMP?14和EMMPRIN在恶性神经鞘瘤中的阳性表达率明显高于良性神经鞘瘤，认为二者与神经鞘瘤的恶性程度可能具有潜在的关联性，对其浸润转移起促进作用。MMP?14和EMMPRIN不但有着各自的促进肿瘤浸润转移的机制，同时二者可分泌和激活MMP?2，使其具备了降解ECM的能力对ECM进行降解，以及二者可上调肿瘤中VEGF的表达水平以利于肿瘤的血管新生，这些可能都是MMP?14和EMMPRIN共同促进Rb浸润转移的机制。MMP?14与EMMPRIN之间也存在相互作用,从而维持其在恶性肿瘤中的表达水平。作为基质金属蛋白酶诱导因子，EMMPRIN可通过刺激肿瘤基质中的成纤维细胞分泌MMP?14,使其在恶性肿瘤中的表达水平升高,从而促进肿瘤的浸润转移［12］。此外，Egawa等［13］通过研究发现，体外培养的人类肿瘤细胞HT1080 和A431可以向培养基中释放一种分子量为22?kDa 的EMMPRIN片断，此种释放与肿瘤细胞中MMP?14水平密切相关，他们将其称为“MT1?MMP依赖性劈裂”。此片断具有维持EMMPRIN蛋白功能和上调人成纤维细胞MMP?2表达水平的作用，而下调这种肿瘤细胞中的MMP?14水平可以抑制EMMPRIN片断的释放，使EMMPRIN的表达水平降低。可见，MMP?14也可对EMMPRIN在恶性肿瘤中的表达水平产生影响。

 

【】
  　　［1］Dalberg K, Eriksson E, Eaberg U, et al. Gelatinase A, membrane type 1 matrix metalloproteinase and extracellular matrix metalloproteinase inducer mRNA expression:correlation with invasive growth of breast cancer［J］. World J Surg, 2000, 24(3):334?340.

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