补骨脂素加长波紫外线对HL?60细胞凋亡的影响
【摘要】 目的：探讨补骨脂素（psoralen, PSO）加长波紫外线（ultraviolet?A, UVA）的光化学疗法（PUVA）对人急性髓细胞白血病（FAB?M2）细胞株HL?60细胞凋亡的作用及部分作用途径。方法：以HL?60细胞株为研究对象，以0、10、20、40、80 μg/ml PSO加波长为360 nm的UVA，作用于HL?60细胞，通过流式细胞仪检测HL?60细胞在PUVA后的凋亡情况；电镜下观察细胞超微结构改变；荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）及流式细胞技术检测Fas配体（Fas ligand, FasL)在基因和蛋白水平的表达情况。结果：单纯PSO、单纯UVA照射及PUVA均可诱导HL?60细胞发生凋亡，PUVA的作用显著强于前两者。电镜下观察经PUVA处理后的HL?60细胞超微结构，可见明显的凋亡形态学改变。PSO、UVA照射及PUVA均可下调FasL在基因、蛋白水平的表达，PUVA的作用显著强于前两者。结论： PUVA可诱导白血病细胞HL?60发生凋亡，作用强于PSO及UVA照射。HL?60被PUVA诱导凋亡后FasL基因表达水平下调。
【关键词】 白血病 HL 60细胞 细胞凋亡 Fas配体 紫外线疗法 光化学疗法 补骨脂素
Methods: The HL?60 cells were taken as the study objects and their apoptosis rates, ultrastructure changes and the expression of FasL were detected in order to observe the effects of PSO and ultraviolet?A (UVA) of wave length 360 nm. The factorial design and analysis of variance were used to analyze the interaction among the factors.
Results: PSO, UVA and PUVA all induced the apoptosis and the effects of PUVA were stronger than those of the other two. After HL?60 cells had been treated with PUVA, they all showed obvious ultrastructure changes due to apoptosis observed under the electron microscope. PSO, UVA and PUVA all decreased the expressions of FasL gene and protein. The effects of PUVA were stronger than those of the other two.
Conclusions: PUVA can induce the apoptosis of HL?60 cells and the effects are stronger than those of PSO or UVA alone. The expression of FasL gene in HL?60 cells is down?regulated during the apoptosis induced by PUVA.
Keywords: leukemia; HL?60 cells; apoptosis; Fas ligand; ultraviolet therapy; photochemotherapy; psoralen
补骨脂素（psoralen, PSO）是中药补骨脂种子中的主要成分，研究表明其具有光敏性质与抗肿瘤活性。本实验从中药补骨脂中提取出PSO，以不同浓度PSO加波长为360 nm的紫外线（ultraviolet?A, UVA）（简称PUVA），作用于HL?60细胞，通过流式细胞仪检测HL?60细胞在PUVA后的凋亡情况；电镜下观察细胞超微结构改变；荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）及流式细胞技术检测Fas配体（Fas ligand, FasL)在基因和蛋白水平的表达，以探讨PUVA法诱导HL?60细胞凋亡的作用及部分作用途径。
1 材料与方法
1.1 细胞株 人急性髓细胞白血病?M2型HL?60细胞株由大连医科大学惠赠。
1.2 药品及主要试剂 PSO由大连理工大学及人民解放军第210合作从中药补骨脂中提取和制备，用乙醇溶剂提取和配制，PSO浓度为5 mg/ml。二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide, DMSO）购自北京化工厂。RPMI 1640培养液购自GIBCO公司。小牛血清购自杭州四季青生物材料工程公司。TRIzol购自美国GIBCO BRL公司。FasL基因检测试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司。鼠抗人FasL（CD95 Ligand）单克隆抗体试剂盒购自美国CALTAGTM Laboratories。
1.3 仪器和设备 EPICS XL型流式细胞仪由美国贝克曼库尔特公司生产，GLY?10型光量子血液平衡仪由徐州华卫医疗设备公司生产，DA7600型荧光定量PCR仪由中山大学达安基因股份有限公司生产。
1.4 细胞培养 HL?60细胞常规培养于含15%小牛血清的RPMI 1640培养基（含硫酸庆大霉素0.025 U/ml）中，于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中进行连续培养，每2～3 d换液1次。
1.5 实验分组 依据是否采用紫外线照射和PSO浓度不同将实验组分为HL?60细胞对照组、UVA照射组、PSO各浓度组及PUVA各浓度组，其中UVA照射时间为5 min。
1.6 流式细胞术测定PUVA 24 h后HL?60细胞凋亡的情况 取浓度为4.0×105/ml、处于对数生长期的HL?60细胞5 ml，分别加入PSO 0、10、20、40和80 μl，使PSO在反应体系中的终浓度分别为0、10、20、40、80 μg/ml，放入石英比色皿中，在GLY?10型光量子血液平衡治疗仪（λ=360 nm）上以1 J/m2辐射量边照射边震荡，照射时间分别为0和5 min。处理后各实验组细胞继续培养24 h，收集5.0×105个细胞，用PBS洗2次，弃上清，加入100 μl碘化丙啶染液，避光反应30 min，加入PBS 400 μl，上机检测，并用MultiCycle软件分析得出相应的细胞凋亡百分率。
1.7 透射电镜下观察细胞超微结构特点 收集浓度为5.0×105/ml、经PUVA处理的HL?60细胞10 ml，用PBS清洗2次，转入10 ml离心管，离心（2 000 r/min）3 min，弃上清，缓缓加入2.5%戊二醛2 ml，4 ℃冰箱静置2 h以上。磷酸缓冲液冲洗，锇酸固定，经水洗、脱水、浸透和包埋，超薄切片，透射电镜（transmission electron microscope, TEM）下观察HL?60细胞超微结构。
1.8 定量PCR技术检测PUVA 4 h后HL?60细胞FasL基因表达情况 总RNA提取，采用TRIzol一步法提取mRNA，按照试剂盒说明书操作。合成cDNA，反应体系包括：5×逆转录缓冲液4 μl（含Mg2＋ 4 mmol/L）、逆转录酶（200 U/μl）1 μl、脱氧核苷二磷酸（deoxyribonucleoside diphosphate, dNTPs, 10 mmol/L）0.5 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，焦碳酸二乙脂（diethyl pyrocarbonate, DEPC）9.7 μl和RNA模板4 μl，总体积20 μl；反应条件：37 ℃ 1 h，95 ℃ 3 min。将cDNA进行PCR扩增，反应体系包括：5×定量PCR缓冲液10 μl（含Mg2＋ 2 mmol/L）、Taq酶（3 U/μl）1 μl、FasL上游引物1.0 μl、下游引物1.0 μl、各自的荧光探针1.0 μl（上、下游引物，探针的终浓度均为10 pmol/L）、dNTP 1 μl、去离子水（ddH2O）30 μl和cDNA模板5 μl，总体积50 μl；同时将制备的定量模板按照2×108、2×107、2×106、2×105、2×104（拷贝数/μl）梯度稀释，加入不同反应管中，在DA7600型荧光PCR仪进行扩增；反应条件：93 ℃ 2 min、93 ℃ 1 min和55 ℃ 1 min，共40个循环。反应结束后由机自动计算定量结果，再通过换算得出每微克总RNA中FasL的mRNA拷贝数。上、下游引物及探针序列如下。上游引物：5’?CAG TCC ACC CCC TGA AAA A?3’；下游引物：5’?CTT GAG TTG GAC TTG CCT GTT AA?3’； Taqman探针：5’?FAM?AGG AGC TGA GGA AAG TGG CCC A?TAMRA?3’。引物及探针由中山大学达安基因股份有限公司合成。
1.9 流式细胞术测定PUVA 24 h后HL?60细胞FasL蛋白表达情况 收集HL?60细胞1×106个，PBS洗涤1次后弃上清液，加入100 μl Intraprep Reagent 1，轻轻混匀后室温（18～25 ℃）孵育15 min，加入4 ml PBS，300×g室温下离心5 min，加入100 μl Intraprep Reagent 2，轻轻混匀后室温孵育5 min，加入PE标记的FasL，避光孵育15 min，加入4 ml PBS，300×g室温下离心5 min，弃上清液，重悬细胞于500 μl PBS中，上机检测FasL蛋白表达，以PE?IgG1做阴性对照。
1.10 统计学方法 计量资料数据以x±s表示，采用多因素方差分析进行组间比较；所有统计用SPSS 11.5 统计软件进行，P＜0.05被认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PUVA后24 h HL?60细胞凋亡率 流式细胞仪检测结果显示，与HL?60细胞对照组比较，单纯10、20、40和80 μg/ml PSO作用HL?60细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（P<0.01）；单纯UVA照射可增加HL?60细胞凋亡率，与HL?60细胞对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。PUVA较单纯PSO更能提高HL?60细胞的凋亡率，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。
表1 PUVA后24 h HL?60细胞凋亡率和FasL mRNA及蛋白表达（略）
Table 1 Apoptotic percentages of HL?60 cells and expressions of FasL mRNA and protein in HL?60 cells after 24?hour PUVA treatment
**P<0.01, vs HL?60 cell control group; △△P<0.01, vs same dose PSO group.
2.2 透射电镜下观察PUVA后细胞超微结构的改变 电镜下观察：HL?60细胞出现细胞体积缩小；胞浆浓缩；胞核体积减小，可裂解成一个或数个致密体，可见核小体碎裂；核染色质聚集或边集，部分染色质致密成斑块状或沿核膜收缩成新月体状；整个细胞可裂解成大小不一凋亡小体。见图1。
图1 PUVA 24 h后HL?60细胞超微结构改变（略）
Figure 1 Change of ultrastructure in HL?60 cells after 24?hour PUVA treatment
A: TEM, ×2 500; B: TEM, ×6 000.
2.3 PUVA 4 h后HL?60细胞FasL mRNA表达的情况 荧光定量RT?PCR检测结果显示，与HL?60细胞对照组比较，PUVA可下调FasL mRNA的表达（P<0.01）。单纯10、20、40和80 μg/ml PSO作用后，与HL?60细胞对照组比较，可下调FasL mRNA表达，差异亦有统计学意义（P<0.01）。见表1。
2.4 PUVA 24 h后HL?60细胞FasL蛋白表达情况 流式细胞术测定结果显示，与HL?60细胞对照组比较，PUVA可下调FasL蛋白的表达（P<0.01）。单纯10、20、40和80 μg/ml PSO和单纯UVA可下调FasL蛋白表达，与HL?60细胞对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。
3 讨论
PSO具有抗肿瘤和抗白血病的作用，同时又具有光敏活性［1?5］，波长范围在320～360 nm之间的紫外光照射，可激发补骨脂素的动力效应［6］，从而增强其抗肿瘤及抗白血病的作用。本实验采用紫外波长为360 nm的GLY?10型光量子血液平衡仪和中药补骨脂中提取的PSO，或两者单用对HL?60细胞株进行处理，对细胞凋亡率，电镜下超微结构改变进行检测和分析，证实PUVA对HL?60细胞有明显的诱导凋亡的作用，可以说明诱导白血病细胞凋亡是PUVA杀伤人类白血病细胞的途径之一。多因素方差分析结果显示，PUVA可诱导HL?60白血病细胞发生凋亡，与HL?60细胞对照组相比，10、20、40和80 μg/ml PSO与UVA照射对HL?60白血病细胞的凋亡率有明显差异；单纯PSO组与相同浓度PUVA组比较，PUVA要显著强于前者。提示PUVA诱导HL?60细胞凋亡的作用要强于PSO。
Fas/FasL系统在传递细胞凋亡信号中起着重要作用［7］。HL?60细胞FasL表达增强，细胞表面FasL表达使Fas高表达的激活T淋巴细胞发生凋亡，从而导致肿瘤细胞逃避机体免疫系统监视，在体内无限增殖。荧光定量PCR技术检测结果显示，PSO、UVA和PUVA均可下调FasL基因表达，且PUVA的作用要显著强于前两者，经PUVA作用后，FasL基因表达拷贝数量级由对照组的107下调至105。流式细胞仪检测在蛋白质水平上进一步证实了上述结果。由此我们认为，PUVA诱导HL?60细胞发生凋亡的过程可能与下调FasL基因的表达有关。
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