补阳还五汤及其有效组分生物碱和苷对大鼠血管内膜损伤后主动脉内膜增生和增殖细胞核抗原表达的影响
【摘要】 目的：探讨补阳还五汤及其有效组分生物碱和苷类对大鼠血管内膜损伤后主动脉内膜增生和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）表达的影响。方法：用国产2.0 F球囊导管建立大鼠主动脉内皮剥脱模型，术后第1天开始灌胃给药，术后第15天取胸主动脉血管损伤段测定内膜增生程度及增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）的表达。结果：剥脱术后第15天，模型组大鼠主动脉内膜出现显著增生。与假手术组比较，术后各组中膜增生不明显(P＞0.05)，内膜增生明显(P＜0.01)。生物碱组、苷组、补阳还五汤原方组和阿伐他汀组血管内膜增生程度轻于模型组(P＜0.01)。模型组PCNA表达高于假手术组(P＜0.01)。生物碱组、苷组、阿托伐他汀组PCNA表达高于假手术组(P＜0.05, P＜0.01)，但均低于模型组(P＜0.01)。补阳还五汤原方组大鼠PCNA表达高于假手术组(P＜0.01)，虽低于模型组，但差异无显著性意义(P＞0.05)。结论：补阳还五汤有效组分生物碱和苷类均可抑制血管内皮剥脱后的血管内膜增生，可能为补阳还五汤抗血管内膜增生的药效物质基础之一，其抗血管内膜增生的作用可能与降低PCNA表达有关。
【关键词】 补阳还五汤 生物碱 苷 球囊导管 血管平滑肌细胞 形态计量学 增殖细胞核抗原
Objective: To explore the effects of alkaloids and glycosides extracted from Buyang Huanwu Decoction (BYHWD), a compound of traditional Chinese herbal medicine, on aortic intimal hyperplasia and the expression of the proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in rats with aortic intimal injuries.
Methods: The vessel restenosis model was established by denuding aortic endothelium with domestic balloon catheter in rats. Drugs were administered intragastrically on the first day after operation. The injured segments of aorta were taken on the fifteenth day after operation to determine the degree of intimal hyperplasia and observe the expression of PCNA.
Results: Aortic intimal hyperplasias were very obvious on the fifteenth day after operation. The media hyperplasias in the drug?treated groups were not significant (P＞0.05), but the intimal hyperplasia were remarkable as compared with that in the sham?operated group (P＜0.01). The degrees of intimal hyperplasia in BYHWD, alkaloids, glycosides and atorvastatin groups were less than that in the untreated group (P＜0.01). There was significant difference of PCNA expression between the untreated group and the sham?operated group (P<0.01). The expressions of PCNA in alkaloids, glycosides, and atorvastatin groups were higher than that in the sham?operated group (P＜0.01, P＜0.05), but still lower than that in the untreated group (P＜0.01). The expression of PCNA in BYHWD group was higher than that in the sham?operated group (P＜0.01), and no significant difference was found between the BYHWD group and the untreated group (P＞0.05).
Conclusion: Alkaloids and glycosides extracted from BYHWD can inhibit intimal hyperplasia induced by denuding arterial endothelium with domestic balloon catheter in rats. Alkaloids and glycoside may be among basal substances in BYHWD inhibiting intimal hyperplasia of blood vessel, the effect of which may relate to down?regulating the expression of PCNA.
Keywords: Buyang Huanwu Decoction; alkaloids; glycosides; balloon catheter; vascular smooth muscle cell; morphology; proliferating cell nuclear antigen
血管内膜损伤后，血管内皮细胞受损，管壁组织暴露，促使血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)发生表型转化和增殖，这是导致血管狭窄的主要原因之一。前期研究表明，用国产2.0 F球囊导管致大鼠主动脉内膜剥脱损伤后，在术后14～21 d出现明显的血管内膜增生而引起血管狭窄，其内膜增生主要是由于VSMC增殖所致［1］。补阳还五汤（Buyang Huanwu Decoction, BYHWD）是防治心脑血管缺血性疾病常用的有效方剂。前期研究表明，该方中有效组分生物碱和苷可抗缺血性脑损伤，并对血管内皮细胞的抗血栓功能具有改善作用，提示生物碱、苷可能为该方中具有血管效应的物质基础之一［2］。稽波等［3］也发现气血并治方防治动脉粥样硬化的作用可能与方中有效组分芍药苷和总黄酮配伍抑制氧化低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞损伤条件培养基引起的VSMC增殖相关基因的表达有关。为此，本研究采用大鼠球囊导管损伤主动脉内膜增生模型，研究补阳还五汤中有效组分生物碱和苷抗血管内膜增生的作用，旨在为其应用提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 清洁级健康SD大鼠，140只，由湖南省卫生防疫站实验动物中心提供。体质量300～350 g，雄性，合格证号为医动字第20?010号。
1.1.2 球囊导管 球囊由天津中拓乳胶科技有限公司提供；导管（5.5号针头改装成）由河北医科大学基础医学研究所生物化学室韩梅教授惠赠。国产2.0 F球囊导管由球囊和导管组装而成［1］。
1.1.3 实验试剂 增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）免疫组化染色试剂盒、二氨基联苯胺显色试剂盒和多聚赖氨酸由武汉博士德生物工程有限公司提供，亮绿由丽欣生物技术有限公司提供，其他试剂为进口或国产分析纯。
1.1.4 实验药物 阿托伐他汀片（atorvastatin，为VSMC增殖抑制药物），商品名立普妥，规格10 mg/片，德国Godecke GmbH生产，辉瑞制药有限公司分装，批号为65837019，临用时以去离子蒸馏水配成1 mg/ml混悬液。补阳还五汤原方由黄芪60 g、赤芍9 g、川芎6 g、当归9 g、地龙9 g、红花9 g和桃仁9 g组成。以水煎醇沉法制备补阳还五汤原方提取液，生药浓度1.11 g/ml。原方提取液再采用酸碱沉淀和离子交换树脂层析等方法提取生物碱、苷，原液煎取和提纯均由湖南中医药大学药学院中药制剂实验室完成。两类有效组分分离完全，相互之间无混杂。苷类有效组分主要含黄芪皂苷、芍药苷、苦杏仁苷和黄酮苷等。生物碱类有效组分主要含川芎嗪和阿魏酸等。全方提取物和各有效组分提取物的高效液相色谱测定图谱见图1。以高效液相色谱法（high?performance liquid chromatography, HPLC）测定有效组分中质控物的含量，苷提取液中质控物黄芪甲苷含量为1.4 mg/g苷，以去离子蒸馏水配成0.71 g苷/ml；生物碱提取液中质控物川芎嗪含量为6 mg/g生物碱，以去离子蒸馏水配成0.083 g生物碱/ml。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型建立方法 大鼠主动脉内皮剥脱模型建立参照［1］改良：大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，作颈部正中切口，暴露并游离左颈总动脉1～1.5 cm，远心端结扎，在左颈总动脉近心端用动脉夹阻断后，于颈总动脉远心端剪一“V”形切口，插入国产2.0 F球囊导管，仔细操作导管越过主动脉弓入胸，下至腹主动脉，深度约为6～7 cm。自导管尾端注入生理盐水0.2～0.4 ml充盈球囊，使球囊膨胀至回拉时有较明显的阻力感，保持阻力一致缓慢回拉导管至主动脉弓处，如此重复6次，再以导丝为轴线旋转球囊180度，使球囊转至血管腔的另一面，依上法再重复6次，充分剥脱内皮。完成后撤出导管，结扎左颈总动脉近心端血管以止血，逐层缝合肌肉、皮下层及皮肤层。术后腹腔注射青霉素20万U消炎抗菌，连用3 d。另设假手术组为对照，只进行手术操作，但不插入球囊，其他操作与各实验组相同。
图1 补阳还五汤全方和生物碱、苷有效组分HPLC图谱（略）
Figure 1 HPLC determination spectra of BYHWD integral prescription and alkaloids, glycosides extracted from BYHWD
A?1: Tetramethylpyrazine; A?2: Alkaloids; A?3: BYHWD. B?1: Astragaloside Ⅳ; B?2: Ferulic acid, amygdalin, paeoniflorin; B?3: Glycosides; B?4: BYHWD.
实验过程中若发觉球囊在大鼠体内破裂，针管回抽有血，或球囊在大鼠体内有破损，球囊充盈不理想，或剥脱过重造成髂动脉血栓形成，致大鼠术后单下肢瘫或双下肢全瘫者均应剔除。
1.2.2 实验分组 大鼠先按体质量分层后，再随机分为假手术组、模型组、阿托伐他汀组、补阳还五汤原方组、生物碱组和苷组。每组动物剔除实验中死亡或不成功者，最后保证每组动物数为10～12只。
1.2.3 给药及实验方法 于造模后第1天起开始给药，假手术组和模型组灌胃等量蒸馏水，阿托伐他汀组灌胃阿托伐他汀（10 mg/kg），补阳还五汤原方组灌胃补阳还五汤原方（11.1 g /kg，按生药），生物碱组灌胃生物碱类有效组分（0.83 g/kg），苷组灌胃苷类有效组分（7.1 g/kg），1次/d。灌胃连续7 d后称取体质量，根据体质量调整给药用量，再连续灌胃7 d。分别于造模后第15天麻醉后处死动物。取出损伤段胸主动脉，分3段（距主动脉弓1 cm、距膈肌入孔处1 cm、中间段约1 cm）固定、脱水、透明、包埋并进行检测。
1.2.4 血管内膜增生的形态学及血管形态计量测定 在内皮剥脱段胸主动脉相同部位取血管1 cm，4％多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，每段血管间断均匀切片8～10张后，Masson法三色染色后，每只大鼠标本各随机取3片在光学显微镜下观察和照相，进行血管形态计量测定。按组织学划分，内弹力膜以内为内膜，内弹力膜与外弹力膜之间为中膜。以MIAS医学图像分析系统（北航公司生产和设计）分别测量外弹力膜内面积、内弹力膜内面积、管腔面积。并在此基础上计算出中膜面积（media area, MA）、内膜面积（intimal area, IA）、中膜厚度（media thickness, MT）、内膜厚度（intimal thickness, IT）、内膜面积增生比率（hyperplasia ratio of intimal area, HRIA）、内膜厚度增生比率（hyperplasia ratio of intimal thickness, HRIT）、内膜/中膜面积比（IA/MA）和内膜/中膜厚度比（IT/MT）。计算公式如下。
MA=(外弹力膜内面积－内弹力膜内面积)
IA=(内弹力膜内面积－管腔面积)
MT=(外弹力膜内面积π－内弹力膜内面积π)
IT=(内弹力膜内面积π－管腔面积π)
HRIA=［(内膜面积)/(内膜面积+中膜面积)×100％］
HRIT=［(内膜厚度)/(内膜厚度+中膜厚度)×100％］
1.2.5 血管内膜PCNA表达测定 采用免疫组织化学法，光学显微镜下观察PCNA的表达变化，以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性表达信号。各组均设立1个阴性对照（以PBS替代一抗）。用MIAS图像分析系统对表达信号进行分析。结果以灰度值表示，灰度值越小，表示相关的抗原表达越强。
1.3 统计学方法 应用SPSS 11.5统计软件进行分析，实验结果所有数据均采用x±s表示。原始数据方差不齐时，对数据取对数进行变量变换，使各组数据均符合正态性和方差齐性要求。多组间均数比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验。
2 结果
2.1 各组大鼠血管形态学变化 假手术组大鼠主动脉壁各层结构完整，管腔面积无缩小，内膜光滑无增生，中膜VSMC排列整齐。模型组大鼠胸主动脉内膜呈弥漫性增厚，管腔面积明显缩小，增厚的内膜中以VSMC为主，中膜细胞排列紊乱。补阳还五汤原方组、生物碱组、苷组和阿托伐他汀组内膜均有增生，管腔口径有不同程度缩小，但增生程度明显轻于模型组。见图2。
2.2 各组血管形态计量指标比较 各组中膜面积和中膜厚度比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。模型组、生物碱组、苷组、补阳还五汤原方组和阿托伐他汀组的内膜面积、内膜厚度、内膜面积增生比率、内膜厚度增生比率、内膜/中膜面积比、内膜/中膜厚度比均比假手术组增加(P＜0.01)，且生物碱组、苷组、补阳还五汤原方组、阿托伐他汀组的内膜面积、内膜厚度、内膜面积增生比率、内膜厚度增生比率、内膜/中膜面积比、内膜/中膜厚度比均低于模型组(P＜0.01)。见表1。
2.3 各组增生内膜PCNA表达的比较 假手术组未见到PCNA阳性细胞。模型组增生内膜中可见到大量PCNA阳性细胞，分布在新生内膜和中膜中。生物碱组、苷组和阿托伐他汀组新生内膜中也可见到散在的PCNA阳性细胞。补阳还五汤原方组仍可见到较多的PCNA阳性细胞。各组PCNA表达比较表明，模型组PCNA表达较假手术组显著增强(P＜0.01)。生物碱组、苷组和阿托伐他汀组PCNA表达较假手术组也均显著增强(P＜0.05, P＜0.01)，但均低于模型组(P＜0.01)。而补阳还五汤原方组PCNA表达高于假手术组(P＜0.01)，其表达强度虽略低于模型组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1和图3。
图2 各组大鼠血管形态学（光学显微镜,×100）（略）
Figure 2 Vascular morphology of rats in different groups (Light microscopy, ×100)
A: Sham?operated group; B: Untreated group; C: Atorvastatin group; D: BYHWD group; E: Alkaloids group; F: Glycosides group. Arrows indicate the region of intimal hyperplasia.
表1 各组大鼠血管形态学计量指标及PCNA表达的比较（略）
Table 1 Measurement parameters of vascular morphology and expressions of PCNA of rats in different groups
*P<0.05, **P<0.01, vs sham?operated group; △△P＜0.01, vs untreated group.
图3 各组大鼠内膜PCNA表达的免疫组化结果(光学显微镜，×400)（略）
Figure 3 PCNA expressions in intima of rats in different groups by immunohistochemistry (Light microscopy, ×400)
A: Sham?operated group; B: Untreated group; C: Atorvastatin group; D: BYHWD group; E: Alkaloids group; F: Glycosides group. Arrows indicate the region of intimal hyperplasia.
3 讨论
动脉粥样硬化、高血压及经皮冠状动脉成形术（percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA）后再狭窄等血管增生性疾病是严重危害人类健康的常见病和多发病，对其形成机制和防治措施的研究也一直是医学界研究的热点。VSMC转化为去分化型时，可从血管中膜迁移至内膜，进一步分裂增殖，并合成和分泌大量细胞外基质（extracellular matrix, ECM），使内膜增厚，形成新生内膜［4, 5］。大量实验已证实了动脉损伤后VSMC的异常增殖是血管增殖性疾病发生的重要因素。在鼠动脉损伤后新生内膜形成的研究中发现，损伤后几小时即出现VSMC的增殖，到第4天增殖的VSMC移行至内膜，2周后VSMC增加3～5倍，占最终内膜细胞总数的90%［6］。VSMC增殖移行的程度决定了预后。当内膜损伤严重时，VSMC过度增殖，则会导致血管重构、管腔狭窄和发生血管增殖性疾病。因而，抑制VSMC过度增殖是防止血管增生性病变的主要方法。
中医学认为，气行则血行，气滞则血瘀，故理气活血为瘀血导致的心脑血管缺血性疾病的主要治疗方法。血管内膜损伤后，由于内膜增生导致血管狭窄，一方面影响血液动力学特性，在受损局部易致血栓形成，导致血液运行异常；另一方面，血管狭窄后使组织血液灌注量不足，导致组织缺血缺氧。中药及复方具有多成分、多效应的特点，对于复杂疾病的成因和可以进行多环节、多靶点、多途径的调节，这种作用特点符合血管内膜增殖性病变的原因和病理生理机制。因此，中医治疗原则以益气活血化瘀为主，这为防治血管增生性病变的发生开辟了一条重要的治疗途径。
补阳还五汤为治疗心脑血管病变的有效方剂，已有的研究表明，该方有抗VSMC增殖的作用。在家兔主动脉和冠状动脉球囊损伤再狭窄实验，补阳还五汤可减轻血管内膜增生病变，其机制与抑制血管内膜血小板衍生生长因子受体基因表达，上调超氧化物歧化酶1基因表达，抑制VSMC增殖，抗自由基损伤有关［7, 8］。我们采用大鼠主动脉内皮剥脱模型，研究补阳还五汤有效组分抗血管内膜增生的作用。结果显示，在术后14 d即可出现明显的血管内膜增生而引起血管狭窄，这主要是由于VSMC向内膜迁移和增殖所致。补阳还五汤原方组、生物碱组、苷组、阿托伐他汀组的内膜面积、内膜厚度、内膜面积增生比率、内膜厚度增生比率、内膜/中膜面积比、内膜/中膜厚度比6项血管形态学计量指标均显著低于模型组，表明补阳还五汤有效组分生物碱和苷可通过抑制VSMC向内膜迁移、增殖从而阻抑血管内膜增生引起的血管狭窄，这两类有效组分可能是该方抗血管内膜增生的药效物质基础之一。
PCNA是脱氧核糖核酸多聚酶的辅助蛋白，它参与DNA的合成，代表细胞的分裂增殖，是反映细胞增殖的一个特异性指标［9］。本研究表明，血管内皮损伤后内膜增生明显，PCNA表达增强，提示VSMC向内膜迁移、增生。生物碱组、苷组、阿托伐他汀组均可降低增生内膜中PCNA的表达，表明补阳还五汤有效组分可能通过抑制VSMC增殖而起到抗内膜增生的作用。而补阳还五汤原方组PCNA表达强度虽略低于模型组，但差异无显著性意义，提示由补阳还五汤提取的两类有效组分生物碱和苷可能为该方具有抑制VSMC过度增殖作用的重要药效物质基础，有效组分的作用强于原方。抗VSMC增殖可能是其抗内膜增生的主要机制之一。这进一步揭示了补阳还五汤及其主要有效组分对实验性血管增生性病变VSMC增殖具有抑制作用，为临床合理防治血管增生性疾病提供了实验依据。
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