乌司他丁对兔百草枯中毒急性肺损伤的保护作用

            作者：卜志勇, 郑 玲, 胡俊华, 杨祖清, 付守芝

【摘要】  目的:探讨乌司他丁对兔百草枯中毒急性肺损伤（ALI）的保护作用及其机制。方法:新西兰白兔30只，随机分为对照组，百草枯组和乌司他丁组。百草枯组和乌司他丁组腹腔内注射百草枯，对照组注射等体积无菌生理盐水，乌司他丁组同时给与乌司他丁。3 d后测支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎症细胞和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）活性和肺叶湿/干重比。结果:百草枯组和乌司他丁组支气管肺泡灌洗液中总细胞数、中性粒细胞数、巨噬细胞数、BALF?NE和肺叶湿/干重比均较对照组增高(P＜0.05)，乌司他丁组各指标明显低于百草枯组(P＜0.05)。 结论:蛋白酶抑制剂乌司他丁对兔百草枯中毒急性肺损伤有保护作用。

【关键词】  乌司他丁；肺损伤；百草枯；气管肺泡灌洗；中性粒细胞弹性蛋白酶

    Abstract:Objective To evaluate the protective effects and mechanisms of ulinastatin in rabbits with paraquat?induced acute lung injury. Methods Thirty rabbits were enrolled and randomly divided into three groups:control group,paraquat group and ulinastatin group.Peritoneal paraquat injection were performed in paraquat group and ulinastatin group,while equal volume of saline was peritonealy injected in control group.Three days later,the number of inflammatory cells and neutrophil elastase(NE) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and the extravascular lung water volume were measured.Results Total cells,neutrophilic granulocytes,macrophage and NE in BALF and the extravascular lung water volume were significantly increased in paraquat group and ulinastatin group (P＜0.05).But their levels were lower in ulinastatin group than in paraquat group. (P＜0.05).Conclusion  In paraquat?induced acute lung injury rabbit models,Ulinastatin can alleviate inflammatory response and lung injury,inhibit NE and possess potential protective effects.

    [Keywords]: Ulinastatin;Acute lung injury;Paraquat;Bronchoalveolar lavage;Neutroequalhil elastase

     随着化的，化学物质对环境和人的危害日趋增多。百草枯是一种广泛使用的高效除草剂，却对人危害巨大，肺是首要靶器官，可以致急性肺损伤，表现为肺水肿、低氧血症、急性呼吸窘迫综合症，多因呼吸衰竭而死亡，死亡率高达40％。乌司他丁(Ulinastatin)是一种典型的Kuniz型蛋白酶抑制剂，有很广的抑酶谱，能够同时竞争性或非竞争性抑制多种水解酶活性及炎性介质的释放[1]。本实验通过测定支气管肺泡灌洗液中炎症细胞和中性粒细胞弹性蛋白酶（BALF?NE）活性，探讨乌司他丁对急性肺损伤的保护作用及其机制。

    1  材料和方法

    1.1  模型制备

    3～6月龄新西兰白兔30只，体重2.0～2.5 kg，雌雄兼有，随机分为3组：对照组、百草枯组和乌司他丁组，每组10只，在12 h光照和黑暗循环条件下饲养，自由饮水和进食。百草枯组用20%百草枯溶液(杭州金帆达化工有限公司)按35 mg/kg腹腔内注射；乌司他丁组在注射百草枯12 h后开始用乌司他丁治疗（50 kU/kg，1次/d），共3次；对照组注射等体积生理盐水。试验过程中，观察动物行为及肺外观变化，以证实造模成功。3 d后空气栓塞法处死动物。

    1.2  BALF炎症细胞和NE活性检测

    于左肺下叶经气管插管缓慢向肺内注入预冷生理盐水10 mL,停留30 min，再将液体吸出，反复3次，纱布过滤，记录回收量，计数肺泡灌洗液（BALF）中细胞总数、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞。取上清，-20 ℃冻存,测定NE活性(×10-3U/L)。

    1.3  肺组织湿/干重比测定

    取右肺上叶，剔除多余结缔组织，拭干表面血液，用天平精确称量其重量即为湿重，放入80 ℃烤箱烘烤48小时后，再次称量其重量即为干重，确定肺湿/干重比。

    1.4  统计学方法

    数据采用均数±标准差(x±s) 表示，单因素方差分析和两样本均数t检验比较各组差异，P＜0.05为有显著意义。

    2  结果

    2.1  灌洗液中炎症细胞含量

    百草枯组和乌司他丁组支气管肺泡灌洗液中炎症细胞含量（炎症细胞总数、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞）明显高于对照组（P＜0.05），而百草枯组则明显高于乌司他丁组（P＜0.05）(表1)。表1  灌洗液中炎症细胞含量 注：与对照组相比▲P＜0.05;与百草枯组相比＃P＜0.05

    2.2  BALF?NE活性变化

    表2可见，对照组活性极低，乌司他丁组和百草枯组活性显著增高(P＜0.05)，但乌司他丁组活性明显低于百草枯组(P＜0.05)。表2  各组NE及肺湿/干重比结果注：与对照组比较:▼P＜0.05;与百草枯组比较：★P＜0.05

    2.3  右肺上叶湿/干重比

    与对照组相比，百草枯组湿/干重比明显增高(P＜0.05)，而乌司他丁组虽较对照组升高，但仍明显低于百草枯组(P＜0.05)（表2）。

    3  讨论

    百草枯，化学名称为1,1?二甲基?4,4?联吡啶二氯化物，通用名Paraquat，为联吡啶类化合物,是一种广泛使用的高效除草剂，对人畜有较强毒性，肺是主要靶器官。肺泡上皮Ⅱ型细胞和气管的Clara细胞能主动摄取百草枯而大量聚积。肺内的百草枯经由NADPH辅助的单还原为自由基，然后再与分子氧形成阳离子及超氧阴离子，经超氧化物歧化酶歧化形成过氧化氢，进一步形成毒性更高的羟自由基，诱导脂质过氧化反应，直接损害主要细胞成分如细胞膜、线粒体等；还可快速激活磷酸戊糖途径，呈剂量依赖性抑制肺内脂肪酸的合成。此外，百草枯可大量消耗NADPH，使肺内许多需NADPH参与的生化反应无法进行[2]。

    既往研究表明：百草枯中毒后肺部呈典型炎性病理变化过程,最终肺泡内形成典型透明膜，与ALI/ARDS病理及病理生理改变极相似，据此建立动物ALL模型[3-4]。本试验中，兔腹腔内注射百草枯(35 mg/kg)后，随着给药时间延长,呼吸变得越来越困难，24 h后鼻腔有淡红色分泌物，食欲渐进性下降；肺外观观察炎症渐进性,从正常粉红色发展到肝样变，与既往报道一致。

    巨噬细胞、中性粒细胞等多种炎症细胞在ALI发病中起重要作用。大量中性粒细胞在肺微血管内聚集，继而与内皮细胞黏附，释放脂质过氧化物、血小板活化因子、花生四烯酸代谢产物、蛋白酶等介质，造成内皮细胞、肺泡上皮细胞和间质成分受损，肺泡毛细血管膜通透性增加而导致肺水肿[5-6]。中性粒细胞一旦激活，本身又将产生一系列的细胞因子和其他炎性介质，形成逐级放大效应。本试验结果显示，百草枯中毒组支气管肺泡灌洗液中炎症细胞总数及分类计数巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞均明显高于对照组，表明百草枯中毒后有大量炎症细胞在肺内渗出、聚集。百草枯中毒经乌司他丁治疗后上述指标虽高于对照组，但炎症细胞总数及巨噬细胞、中性粒细胞则远低于百草枯组。

    NE属中性丝氨酸蛋白酶，是中性粒细胞释放的蛋白酶中的主要成分。NE能分解钙粘连素，从而造成肺纤维网状支架塌陷,肺毛细血管膜通透性增加，大量血浆蛋白和活性物质渗入肺间质和肺泡，引起非心源性肺水肿；NE还能通过破坏或分解表面活性蛋白，使表面活性物质密度降低，从而加重肺不张；还能分解补体，活化激肽、缓激肽、凝血和纤溶系统以及花生四烯酸，诱导细胞因子、生长因子及内皮素等产生，而这些物质又能激活和诱导中性粒细胞产生更多的NE，这些多重效应构成了一个级联放大，进一步加重损伤，导致恶性循环[7-8]。T Kodama 等[9]研究表明：NE不仅是导致组织破坏比较重要的酶，而且也是ALI的最佳评价预测指标。

    乌司他丁不仅能明显抑制NE而且能间接抑制其他炎性介质的产生，如C3a和白细胞介素?6（IL?6）等[10-11]。本研究结果显示，对照组BALF?NE的活性极低，而中毒组NE活性显著增高，但经乌司他丁治疗后NE的活性可明显降低。肺组织的湿/干重比可间接反映肺内漏出液体量的变化，漏出液越多，肺湿/干重比越高，同时灌洗液的回收率也越高。本研究表明，中毒组兔在湿/干重比较对照组明显增高，结合灌洗液中炎症细胞含量、BALF?NE活性变化可以发现兔百草枯中毒后由于中性粒细胞的激活，释放出大量的蛋白酶，破坏肺组织，造成非心源性肺水肿，导致肺充血、间质水肿、炎性细胞聚集及细胞器损伤。应用蛋白酶抑制剂乌司他丁后，可减少中性粒细胞的渗出、抑制NE活性、阻断细胞因子网络进一步失衡，减轻百草枯中毒后肺损伤，起到了一定的保护作用。

【】
  [1]蔡 军,李定纲.乌司他丁的药研究与临床应用[J].中华临床医药杂志,2003,12（4）:106-107.[2]王永进,王泽惠.百草枯中毒治疗的研究进展[J].急救医学,2003,23(6):404-406.[3]卜志勇,胡俊华,付守芝,等.大剂量表面活性物质和地塞米松联用对大鼠百草枯中毒急性肺损伤的治疗作用[J].郧阳医学院学报,2007,26(4):196-198.[4]谢仰民，陈韩秋，陈 穗,等.大鼠急性呼吸窘迫综合征动物模型的建立[J].中国实验动物学学报，2002，10(4)：243-245.[5]叶任高,陆再英.内[M].第六版.北京:人民卫生出版社,2004:143-153.[6]罗富荣.中性粒细胞与急性肺损伤[J]．国外医学·麻醉学与复苏分册，2002,23(2):71-73．[7]Tamakuma S,Ogawa M,Aikawa N,et al.Relationship between neutrophil elastase and acute lung injury in humans[J].Pulm Pharmacol Ther,2004,17（5）:271-279.[8]Zeiher BG,Matsuoka S,Kawabata K,et al.Neutrophil elastase and acute lung injury: prospects for sivelestat and other neutrophil elastase inhibitors as therapeutics[J].Crit Care Med,2002,30（5 Suppl）:S281-287.[9]Kodama T,Yukioka H,Kato T,et al.Neutrophil elastase as a predicting factor for development of acute lung injury[J].Intern Med,2007,46（11）:699-704.[10]Ito K,Mizutani A,Kira S,et al.Effect of Ulinastatin, a human urinary trypsin inhibitor,on the oleic acid-induced acute lung injury in rats via the inhibition of activated leukocytes[J].Injury,2005,36(3):387-394.[11]Bingyang J,Jinping L,Mingzheng L,et al.Effects of urinary protease inhibitor on inflammatory response during on?pump coronary revascularisation:effect of ulinastatin on inflammatory response[J].J Cardiovasc Surg (Torino),2007,48（4）:497-503.