十堰地区女性泌尿生殖道支原体感染状况及其对四环素类抗生素耐药机制研究

             作者：李咏梅, 余光清 李莉 蒋诗琴

【摘要】  目的：了解十堰地区女性泌尿生殖道感染患者支原体感染状况及其对药物敏感性的变化情况，并探讨其对四环素类抗生素可能的耐药机制。方法：1 568例女性泌尿生殖道感染患者，取宫颈分泌物进行解脲支原体(Uu)和人型支原体(Mh)培养鉴定及药敏检测，根据药敏结果随机抽取部分菌株，采用PCR技术扩增四环素类抗生素耐药基因tetM。结果：支原体总感染率为43.5%(682/1 568)；Uu对多西环素、交沙霉素及米诺环素敏感率较高（85.4%、79.8%和78.3%）；阿奇霉素及氧氟沙星的耐药率较高，其敏感率仅为30.8%、25.8%；对米诺环素耐药的支原体耐药株可检出tetM基因。结论：十堰地区支原体的混合感染、耐药性上升趋势十分严重，四环素类药物可以重新作为解脲支原体感染的一线药物。

【关键词】  支原体;抗生素;药物敏感性

    Abstract:Objective To investigate the infectious  status in urogenital tract and changing trend of drug susceptibility of mycoplasma in Shiyan area and associated mechanisms of drug resistance to tetracycline.Methods U.urealyticum(Uu) and M.hominis(Mh) were detected in 1 568 cases with urogenital tract infection,and the susceptibility of clinical strains to antibiotics were determined using Mycoplasma IST kit and based on the susceptibility tested，the resistance gene tetM from strains of urealyticus were amplified by PCR.Results The total positive rate of mycoplasma infection in female was 43.5%, 447 cases were infected by U.urealyticum,and 88 cases by M.hominis and 147 cases were positive with both species.Doxymycin,Josamycin and Minomycin were the most effective agents against Uu strains.The azitromycin and ofloxacin showed a high resistance rate.The resistance strains of U.urealyticum to tetracycline possessed the resistance gene tetM.Conclusion Mixed infection and increasing resistance of mycoplasmas is serious.Multiple resistance to two or more antibiotics are common.Mycoplasma is a predominant pathogen in female genitourinary tract infection,and it is sensitive to Doxymycin,Josamycin and Minomycin.This findings also indicate that resistance monitoring of mycoplasma periodically has important significance in clinical practices.

    Key words:Mycoplasma;Antibiotic;Drug susceptibility assay

     四环素类、大环内酯类及喹诺酮类是既往治疗支原体感染的常用药物，但因抗菌药滥用，使得支原体对四环素产生了较强的耐药性。支原体对四环素的耐药与携带tetM基因密切相关[1-2]。为更好地指导临床合理用药，对我院妇科门诊女性泌尿生殖道感染患者支原体感染情况及其耐药性状况进行了分析，同时对米诺环素耐药的支原体耐药株进行了tetM基因检测，以探究支原体对四环素类药物耐药的机制。

    1  材料与方法

    1.1  病例资料

    选取2006年1月-2007年12月在本院妇科门诊就诊的1 568例女性泌尿生殖道感染患者，初诊疑为非淋菌性泌尿生殖道炎(NGU)，伴有白带增多、有异味、外阴痛痒等症状和体征，或伴有早产、不孕不育病史，年龄21～60岁，平均29.6岁。全部入选患者在检查前一周未应用过任何抗生素。

    1.2  标本采集

    用消毒棉签擦拭宫颈口多余的分泌物，然后用消毒棉拭子在女性宫颈管内1～2 cm处缓慢顺时针旋转3圈，再停留30 s后取出(取样时应尽量避免拭子与阴道壁接触)，置无菌试管内立即送检，尽快接种。

    1.3  支原体培养

    采用液体培养基，将采集的标本插入培养瓶中，挤压旋转数次充分混匀，放35℃～37 ℃培养箱孵育，解脲支原体(Uu)培养基于24 h、人型支原体(Mh)培养基于48 h分别观察结果。

    1.4  药敏试验及结果判断

    采用法国梅里埃生物公司的药敏试验成套试剂盒，选择交沙霉素、阿奇霉素、罗红霉素、米诺环素、多西环素、左氧氟沙星、氧氟沙星、司帕沙星8种抗生素。观察培养瓶有无混浊、变色。培养基和分离鉴定孔不变色为阴性;培养基由橙黄色变为红色且透明清亮为阳性;若培养基变色且混浊，则结果不能解释。24 h内Uu孔变红为Uu阳性，48 h内Mh孔变红为Mh阳性，两孔均变红表示Uu和Mh混合感染。液体培养阳性结果的标本转种支原体固体培养平板，于36.5 ℃，5%～10%CO2条件下培养2～7 d，以镜下见到支原体典型菌落，结合培养基颜色变化进行确认。液体培养与固体培养结果均呈阳性结果的Uu阳性标本进入药敏实验。药敏结果判读：两孔均呈黄色为敏感，低浓度孔呈红色、高浓度孔呈黄色为中介，两孔均呈红色为耐药。

    1.5  PCR检测相关耐药基因

    随机抽取对米诺环素耐药的支原体耐药株20株，按以下方法进行tetM基因检测。

    1.5.1  DNA模板的制备:收集500 μl培养液于Eppendorf管中，12 000 r/min离心2 min，弃上清，加500 μl双蒸水，置98 ℃金属浴中10 min，立即置-20 ℃冰箱冷冻10 min。12 000 r/min离心5 min，上清液为DNA模板。

    1.5.2  引物设计:根据GenBank数据库收录的基因序列信息，采用Primer Premier 5.0软件设计四环素主动外排系统tetM mRNA引物序列，[1]确定引物：上游引物5'?AGTGGAGCGATTACAGAA?3'；下游引物5'?CATATGTCCTGGCGTGTC TA?3'，由上海生物工程公司合成，预期产物长度260 bp。

    1.5.3  PCR反应:反应体系50 μL，在0.5 mL PCR反应管中依次加入:10×缓冲液5 μL， dNTPs(浓度均为2.5 mmol/L) 4 μL， 10 pmol/L上游引物和下游引物各1.5 μL， Taq DNA聚合酶(1 U) 1.25 μL，模板2 μL，双蒸水补至50 μL。以标准菌株作阳性对照，ATCC25922作阴性对照。

    1.5.4  反应程序:94 ℃预变性5 min， 94 ℃变性1 min， 56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环，末次延伸为72 ℃ 5 min，终止反应。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，以碱基对为100 ～1 000 bp的DNA Marker作参照，凝胶成像分析系统观察，分析结果。

    2  结果

    2.1  女性泌尿生殖道感染患者支原体阳性检出率表1  女性泌尿生殖道感染患者支原体阳性检出率由表1可见，1 568例女性泌尿生殖道感染患者，单纯Uu感染447例（28.5%）；Uu合并 Mh感染147例（占9.4%）；单纯Mh感染88例（占5.6%）。在682例女性支原体阳性患者中，单纯Uu感染占65.5%(447/682)， Uu合并Mh感染占21.6%(147/682) ，单纯Mh感染占12.9%(88/682)。

    2.2  支原体药敏试验结果

    对单纯Uu感染的447株临床分离支原体进行耐药性测定，结果显示Uu对8种药物的敏感性由高到低依次为多西环素、交沙霉素、米诺环素、罗红霉素、司帕沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素、氧氟沙星。表2  447例单纯Uu感染患者支原体药敏试验结果

    2.3  支原体tetM耐药基因检测

    PCR检测耐药菌株携带的tetM基因，见图1。

    1为阴性对照,2为阳性对照,

    3～6为不同支原体耐药株,M为Marker。

    图1  支原体耐药株tetM mRNA的表达

    3  讨论

    目前支原体检测最可靠的方法为支原体培养[3]。方法包括液体培养法与固体培养法。液体培养法是根据培养液的颜色改变来判断结果，尽管易出现假阳性，但可进行支原体的药物敏感测定，对指导有较大的帮助。固体培养法是最准确的支原体培养方法，它可以直接看到培养的支原体菌落，没有假阳性，但不能进行支原体的药物敏感性测定，对诊断有帮助，但在指导治疗方面就有缺陷。本研究联合应用两种方法，先用液体方法进行初筛，再用固体培养确诊，最后用液体方法进行药物敏感性检测，既排除了假阳性，又可很好的指导治疗。

    本研究结果显示十堰地区女性泌尿生殖道感染患者两年间支原体感染总检出率为43.5%(682/1 568)，与国内报道[4-5]的40%～50%支原体检出率基本一致。单纯Uu感染的阳性率为28.6%，说明Uu已成为十堰地区女性泌尿生殖道感染的重要病原体。Uu与Mh混合感染率为9.4%，单纯Mh感染率为5.6%，这一结果说明支原体的混合感染已成为女性泌尿生殖道感染的一个新特点，尤其是Mh，以混合感染为主，与国内报道接近[5-6]。本实验结果比1992年赵季文等[7]报道的Uu<17.5%高出很多，也说明了近年来Uu的感染率正逐步上升。从患者的年龄结构来看，十堰地区女性支原体感染患者以20～40岁为主，占全部支原体感染患者的95%(645/682)，因此对该年龄段就诊的患者应仔细检查。

    四环素类、大环内酯类及喹诺酮类是既往治疗支原体感染的常用药物，但由于临床治疗不规范和抗菌药滥用，使得近年来支原体对上述药物产生了较严重的耐药性。Uu对8种药物的敏感性由高到低依次为多西环素、交沙霉素、米诺环素、罗红霉素、司帕沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素、氧氟沙星。但耐药性最高的是氧氟沙星(55.5%)，其次为罗红霉素(41.8%)、左氧氟沙星(40.5%)和阿奇霉素(40.5%)。按照现有中报道的Uu对氟喹诺酮类药物的耐药标准[8]及Mycoplasma IST Ⅱ商业试剂盒的药敏标准，本研究发现十堰地区Uu菌株对氟喹诺酮类耐药率高达40%，这与国内大多数研究结果基本一致[9-10]。鉴于此，认为氟喹诺酮类药物已不再适合用于Uu感染的治疗。

    造成Uu对多种药物敏感性下降的原因可能为：部分患者患病初期没有得到正规的、系统的治疗；很多医师在给患者做检查时只做支原体培养不做药物敏感性试验，效果不理想才做药物敏感性试验。Uu对四环素类药物敏感性变化较小则与临床较少把四环素类作为首选药物有关。大环内酯类药物由于其独特的药代特性以及组织学分布特征，被广泛应用于泌尿生殖道Uu感染的治疗。由于临床习惯在未做药敏试验的情况下首选阿奇霉素等大环内酯类药物治疗，造成Uu对其敏感性下降。

    本组支原体药敏结果与廖朝晖等[11]报道长沙地区支原体药敏基本相同，而与刘玉兰等报道[12]国内其它地区结果有较大差异，提示不同地区支原体对抗菌药物的敏感性有所不同，可能与本地区支原体感染株及抗菌药物的使用有关。本资料支原体耐药性与文献资料[13-16]相比较，对同一药物支原体的耐药率虽有高有低，但对各类抗菌药物的耐药趋势基本上一致。杨文林等[17]认为，同一地区经过一定的时间后，Uu对不同的药物的敏感性也会发生显著的变化，故有条件的医疗机构常规进行支原体培养及药敏检测非常必要。

    四环素类药物抗菌作用的主要机制是通过与细菌核糖体30S亚基结合，该亚基主要由16S  rRNA和一系列蛋白质构成。四环素类药物与细菌30S亚基结合，阻止蛋白质合成的70S始动复合物的形成，并能抑制氨基酰-tRNA进入A位，从而阻止肽链延伸和细菌蛋白质合成。对四环素耐药的微生物大都能够产生一种核蛋白体保护蛋白，这种核蛋白体保护蛋白能与核蛋白体相互作用，使核蛋白体不受四环素类药物的作用，蛋白质合成不受四环素影响，从而表现出对四环素类药物的耐药。tetM 基因是这种核蛋白体保护蛋白的编码基因。

    自从1992年Blanchard等[1]报道Uu对四环素耐药与其携带tetM质粒基因有关以来，有很多的研究都陆续证实了tetM基因与四环素耐药有强关联[2]，本研究结果也支持这一观点。由于没有对所有耐四环素类药物的支原体菌株进行tetM基因检测，所以尚无法判断tetM基因跟耐药菌株的关联强度。值得注意的是，在对米诺环素耐药的20株支原体耐药菌株中，并不是所有的耐药株均检测到了tetM基因。20株支原体耐药株仅17株tetM基因阳性，其余3株未检测到，表明tetM基因是介导四环素类药物耐药的重要机制，亦可能不是唯一机制，尚有待进一步研究。

    细菌对四环素类药物的耐药性主要是通过耐药质粒介导的，表现为获得性耐药。随着近年来对四环素药物的停用或少用，Uu对四环素类药物的敏感性又逐渐提高。目前十堰地区Uu对新型的四环素类药物仍高度敏感，对于单纯Uu感染，可考虑重新调整作为治疗Uu感染的一线药物。鉴于支原体感染率及耐药率的上升，对女性泌尿生殖道感染患者应进行常规支原体培养，并根据药敏试验选择敏感药物。这样既可提高疗效，及时动态掌握支原体耐药变迁情况，又可避免滥用抗生素造成耐药菌株和耐药率的增加。推荐多西环素、交沙霉素、米诺环素为治疗支原体感染的首选抗生素。

【文献】
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