基于磁珠处理的MALDI?TOF实验技术优化
【摘要】 目的：利用基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱（matrix?assisted laser desorption/ionization time?offlight mass spectrometry，MALDI?TOF MS）技术检测血清中蛋白，目前常用磁珠来分离提纯，本研究目的是寻找一套有效的血清样品收集、处理、存储方法，应用于蛋白组学分析。方法：采用磁珠分离提纯人体血清，利用MALDI?TOF技术检测1 000～10 000 Da范围蛋白或多肽，考察其重复性及血清不同的冻融次数和基质与样品搭配比例对结果的影响。结果：人类血清的质谱图在1 000～10 000 Da范围内可检测到230多个峰，重复性极好。样品多次冻融对小分子量的多肽有一定影响。在适当范围内改变样品与基质比例对结果无影响。结论：基于磁珠分离提纯的MALDI?TOF技术在应用于人体血清检测时应用标准化程序可以减少变异。
【关键词】 蛋白质组学 磁珠疗法 基质辅助 激光解析离子化飞行时间质谱
【ABSTRACT】 Objective:Magnetic bead purification for the analysis of proteins in human blood serum facilitates the identification of potential new biomarkers with matrix?assisted laser desorption/ionization time?offlight mass spectrometry（MALDI?TOF MS).The purpose of the study was to establish a proteome fractionation technique and to validate a standardized blood sampling,processing,and storage procedure for proteomic pattern analysis.Methods:Magnetic bead separation was used for proteome profiling of human blood by MALDI?TOF MS（mass range,1 000～10 000 Da)and the effects on the reproducibility of the proteome analysis of the number of freeze?thaw cycles of samples and ratio of sample and matrix were studied.Results:The proteome pattern of human serum was characterized by 230 signals in the mass range of 1 000～10 000 Da.Serum mass patterns differed between samples in different freeze?thaw cycles,espeaially in low?weight molecule peptides.Different ratios of sample and matrix showed no effects on proteome profiling.Conclusion:Application of the standardized preanalytical blood sampling and storage procedure in combination with magnetic bead?based fraction decreases variability of proteome patterns in human serum assessed by MALDI?TOF MS.
【KEY WORDS】 Proteomics,Magnetic Bead Therapy,MALDI?TOF MS
利用质谱进行蛋白质组学研究是近年兴起的、较为有效的研究方法，特别对于发现潜在的生物标志物，用以鉴别健康与疾病具有重大意义[1，2]。SELDI?TOF和MALDI?TOF技术在用于发现生物标志物方面国内外均有报道，他们与以往的双向电泳、多维液相色谱技术不同，灵敏度更高，而且工作量减少，节省时间。SELDI?TOF主要是将待测样品的多肽或蛋白片断浓缩于经过修饰的靶面，直接上质谱。其最早的临床报道是鉴别癌症，例如卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌和肺癌等，并且具有极高的灵敏度和特异度，引起轰动[3～9]，但重复性较差，同样的癌症利用相同的技术平台却得到不同的质谱图[10]，不同的实验室、相同实验室不同时间检测结果亦均不同，因此受到众多研究者的质疑。质疑主要集中在三个方面，第一，实验设计和数据的统计处理过程；第二，质谱技术本身的局限性；第三，所获得的数据的生物学意义[11]。
此次我们利用磁珠（其表面经预处理，抓取蛋白的表面积远大于SELSI?TOF的固体芯片，故又称液体芯片）进行血清蛋白提纯，观察质谱结果。
1 材料与方法
1.1 一般资料 随机选择男女各5人，血样品取自河北医科大学第四附属，患者清晨空腹，聚丙烯干燥管抽血5mL，室温静置1h，然后4 500转/min离心5min，取血清分装，-80°保存，分析时混合为一个样本。分离用成套试剂购自德国Bruker Daltonics公司，磁珠粒径小于1μm，选用Cu离子螯合磁珠进行分析。分析中所用的三氟乙酸、乙腈、乙醇、丙酮等均为色谱纯，购自BD公司。标准品为preptide和protein混合物，德国Bruker公司提供。
质谱仪用AutoflexШ型，产自德国Bruker公司，方法采用线性阳离子模式，参数设置如下：第一离子源20kv；第二离子源18.97kv；检测范围1 000～10 000 Da。每个样品点4个靶点，每个点50shots，选8个不同位置累计400shots。为获得更好的质谱图，第一次可以选择8～10次高能量激光轰击，然后换成低激光能力轰击。
1.2 方法 仪器操作、数据分析和图像采集分别用flexControlMS3.0、ClinProToolsTM2.1和flexAnalysis3.0软件。信噪比大于4者纪录。首先检测未经处理的样品质谱图，然后检测经过Cu磁珠处理的冻融1、3、5次后的样品，比较分析冻融次数的影响；评估重复性时，对同一样品进行不同时间10次检测，选择9个峰（代表高、中、低分子量），以质谱峰下面积为强度，变异系数进行评估；样品与基质的比例选择1/10、1.4/10、1.6/10三种，分别检测观察区别。
2 结果
2.1 反复冻融对质谱图的影响
未经磁珠处理过的样品质谱无任何峰形显示（图略），冻融1、3、5次后采到的质谱图见图1、2。
未经磁珠处理的样品几乎见不到峰信号。冻融一次的样品峰信号最强，随着冻融次数的增多，在2 800 Da以内信号逐渐减弱，冻融5次后较明显。而7 500 Da以上信号减弱不明显。
2.2 重复性观察
标准品和混合样品（Cu磁珠处理）不同时间检测结果，选择高、中、低分子量三个范围9个峰，计算10次检测的变异系数。表1显示，标准品变异系数范围在1.26%～30.79%，混合样品变异系数范围在1.55%～30.22%。
2.3 不同样品基质配比的质谱图图1 反复冻融次数对质谱图的影响（<3 000 Da）图2 反复冻融次数对质谱图的影响（>7 500 Da）表1 不同时间检测标准品和样品变异度比较不同样品基质配比的质谱图见图3。
3．讨论
蛋白质谱图在发现疾病相关蛋白和后续蛋白鉴定方面具有光明的前景[12，13]，然而在重复性、灵敏性等方面仍有很多问题，影响了该技术在临床中的应用与推广。研究发现基于磁珠提取技术的MALDI?TOF是一种精确的、快速的、有价值的技术。在设置信噪比为4的情况下，在1 000～10 000 Da范围内可以检测到230个峰信号，其中很可能有潜在的、有价值的与疾病相关的生物标记。
重复性研究显示，变异系数范围在1.26%～30.79%之间，略低于以往报道的11%～25%、3%～33%[14，15]，在可接受范围内，说明重复性较好。值得注意的是，不同时间检测峰信号的强度不同，时间放置越长，信号越弱，但在进行变异系数时，采用峰面积作为相对强度，因考虑到峰高和峰宽，即峰的分辨率和峰强度，因此较以往文献更为合理和真实。
样品的前处理很重要，其中冻融次数对质谱出峰情况有影响，研究中发现小于2 800 Da分子量的蛋白或多肽受影响较大，而7 500 Da以上者影响较小，因此若对小分子量范围的蛋白或多肽感兴趣，冻融次数不要超过3次。
在质谱分析时，可能由于样品量不够而出现信号强度弱，此时可适当提高样品与基质的比例，但比例搭配应在一定范围内。本研究显示，样品与基质的比例选择1/10、1.4/10、1.6/10三种，质谱图未见差异，由图3 样品与基质不同配比的质谱图于基质的作用就是保护样品不被激光打碎，保持其结构完整性。在激光轰击时，样品蛋白含量越高需要的能量越大，需要摸索。
综上所述，MALDI?TOF是一种高灵敏度的研究平台，严格操作程序可以减少变异，提高结果的重复性和可信性。因此标准化是目前急需解决的问题。根据经验，应在以下几个方面注意：①实验过程中所用到的试剂和器械最好全部要进口，以保证质量；②血清收集一定要严格统一，-80°保存，反复冻融在3次以内影响不大；③样品前处理按照试剂盒说明书进行，但由于基质、乙腈等极易挥发，所以在操作时要逐个进行，不要批处理；④样品点靶时，为了提高准确性，建议每8个样品加一个标准品进行质量控制。
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