人肝癌细胞总RNA电转染树突状细胞对T细胞的激活效应

                   作者：单铁英 苏安英 唐军民 

【摘要】  目的：采用Trizol一步法提取人肝癌细胞总RNA电转染人外周血树突状细胞（Dendritic Cell,DC），观察其对混合T淋巴细胞的体外激活效应。方法：通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞，用细胞因子体外培养诱导其成为DC。Trizol一步法提取人肝癌细胞总RNA。通过电转染法将人肝癌细胞总RNA导入DC内；通过混合淋巴细胞实验，获取DC激活的特异性效应T细胞。用MTT法测定效应T细胞的增殖率。结果：电转染方法可将人肝癌细胞总RNA导入DC；电转染前后DC分子表达无显著差异。转染了人肝癌细胞总RNA的DC可特异的激活T细胞且增殖率明显增强（P<0.05）。结论：电转染为人肝癌细胞总RNA导入DC提供技术上的可行性；转染了人肝癌细胞总RNA的DC可特异激活T细胞。

【关键词】  树突细胞 核糖核酸 转染 肝肿瘤

    【ABSTRACT】  Objective:To investigate the activation effect in human peripheral blood Dendritic Cell（DC)electransfecting total RNA of hepatocarcinoma cells extracted by Trizol in vitro.Methods:Monocytes obtained from human peripheral blood by density guadient centrifugation were induced into DC in the presence of cytokines in vitro.The total RNA of hepatocarcinoma cells was extracted by Trizol and was eletransfected into monocyte?derived DC.Effective T cells were got by mixed lymphology reaction,in which DC activated T cells gradually,then the proliferation rate of effective T cells could be examined by the MTT method.Results:Electransfection could successfully make RNA into DC.There was no significant difference in DC molecule expression after the electransfection.DC with total RNA of hepatocarcinoma cells could activate specifically T cells and Proliferation rate was significant high.Conclusion:Electransfection provides a technical possibility to make hepatocarcinoma total RNA into DC.DC with total RNA of hepatocarcinoma cells can activate specifically T cells.

    【KEY WORDS】  Dendritic Cells,RNA,Transfection,Liver Neoplasms

    肝癌的手段有多种，但对于进展期肝癌，仍然无法彻底解决肿瘤复发与转移的问题。近年来报道肿瘤细胞RNA转染树突状细胞（Dendritic Cell，DC）可以诱导强烈的抗肿瘤免疫，但在用RNA电转染DC的方法尚无报道，我们研究了肝癌细胞株Bel?7402总RNA电转染的DC对T细胞的体外激活效应，以探索其治疗肝癌的可行性。

    1  材料与方法

    1．1一般资料  新鲜人外周血，购自北京市血库。人肝癌细胞株Bel?7402，由北京大学基础医学院免疫学系惠赠。淋巴细胞分离液（Ficoll，1.077g/mL），购自上海试剂二厂。鼠抗人CD14、鼠抗人MHC?Ⅱ、鼠抗人CD86、鼠抗人CD83、鼠抗人S?100，即用型二步法生物素检测试剂盒（PV9000）、FITC标记的第II抗体工作液购自北京中山生物技术有限公司。TRIZOL试剂盒、绿色荧光蛋白（GFP）mRNA，购自Invitrogen公司。

    1．2  方法

    1.2.1  单核细胞、未成熟树突状细胞（Immature Dendritic Cell,imDC）的获得及培养  取正常人新鲜外周血200mL，以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，在37℃和5%CO2饱和湿度条件下培养2h，取贴壁细胞即单核细胞，加入RPMI?1640液、10%胎牛血清（FCS）和细胞因子rhGM?CSF 1000U/mL；rhIL?4 500U/mL继续培养。第7d收获的细胞为imDC。

    1.2.2  肝癌细胞株Bel ?7402总RNA的获得  常规方法对肝癌细胞株Bel?7402进行培养。以Trizol一步法抽提肝癌细胞总RNA，-20℃保存。测定260nm和280nm分光光度值，估计其纯度并定量，进行RNA电泳观察其18S和28S条带完整性。

    2008年10月单铁英等：人肝癌细胞总RNA电转染树突状细胞对T细胞的激活效应第5期2008年10月河北北方学院学报（医学版）第5期1.2.3  肝癌细胞总RNA电转染imDC并培养为成熟树突状细胞（Mature Dendritic Cell,mDC)  收集诱导7d的imDC，调整细胞浓度为1×107/mL。分两组：一组为人肝癌细胞总RNA、PBS、GFPmRNA分别以50μg/mL与imDC在电转杯中混合。均在300V、500uS的条件下进行电转染。电转染后静置5min，将细胞移入6孔培养板中继续培养。另一组为imDC与上述浓度的人肝癌细胞总RNA混合，两组均培养3d即为mDC。

    1.2.4  T细胞的获得  按上述获得单核细胞的方法，取非贴壁细胞即为淋巴细胞，将3×107/mL的淋巴细胞注入尼龙毛柱，放入37℃，5%CO2培养箱静置1h。用预温的37℃含20%小牛血清RPMI?1640培养液洗柱，洗下的即为T细胞，并将其放入上述培养液和细胞因子rhIL?2 500U/mL；于37℃和5%CO2饱和湿度条件下培养待用。

    1.2.5  mDC促进T细胞增殖实验  用T细胞培养液悬浮上述T细胞为2×105/100μL，以100μL/孔加入96孔板，作为反应细胞。分别取5×106/mL电转染人总RNA的mDC和与肝癌细胞总RNA共培养的mDC作为实验1组和实验2组，经电转染PBS的mDC作为对照组，以丝裂霉素(25μg/mL)灭活45min，用RPMI?1640洗3遍，作为刺激细胞。调整mDC浓度2×103/孔、1×104/孔、2×104/孔分别与T细胞混合，总体积200μL/孔，每组设5个复孔。置37℃，5%CO2孵箱培养120h,于最后18h加入10μL MTT(5mg/mL)。收集细胞，酶标仪检测OD值，结果以5孔平均值表示。

    增殖指数为：实验组OD值?反应细胞对照组OD值?刺激细胞对照组OD值/反应细胞对照组OD值。

    1.2.6  数据处理  所得数据经SPSS11.0软件进行处理，样本均数的比较采用t检验。

    2  结果

    2．1  培养imDC的形态学观察及表型分析  细胞体积增大，形态为长梭形或不规则形，并向四周伸出不规则状的突起。表型分析:MHC?Ⅱ+、S?100+、CD86weak+、CD83weak+。

    2．2  肝癌细胞总RNA质量检测  本试验中经Trizol提取的肝癌细胞总RNA，107个细胞可得到4～8μg RNA，经RNA电泳，可见到完整的18S和28S条带，分光光度计检测OD260/OD280=1.82＞1.8。证明所用RNA未降解，质量可靠。

    2．3  电转染人肝癌细胞总RNA后的imDC的形态学观察及表型分析  电转染24h后，细胞处于稳定状态，开始贴壁生长，有少量的死亡细胞呈脱壁生长，形态变差，但绝大多数细胞可恢复至电转染前的正常状态。24h台盼蓝测电转后细胞死亡率为15%～25%。荧光显微镜下可见：在450～490nm的波长观察GFPmRNA电转染后的imDC，电转染4～5h后imDC内表达黄绿色荧光，此荧光可持续表达24～30h。细胞计数：细胞中表达GFP的细胞占细胞总数的49.07%。

    表型分析：接受电转染人肝癌细胞总RNA后imDC的表型无明显变化（P>0.05）：电转染前后imDC分子表达的图像分析见表1。表1  电转染前后imDC表型图像分析结果

    2．4  mDC的形态观察及表型分析  细胞悬浮生长，体积较大，大小不等，呈圆形，细胞表面有突起，呈毛刺样，细胞突起变细，变多，细胞突起在培养液中可摆动或伸缩。细胞核为一个，居中。

    表型分析：MHC?Ⅱ+、CD86+、S?100+、CD83+。imDC与mDC分子表达的图像分析见表2。表2  imDC与mDC表型图像分析结果

    2.5  T细胞增殖实验结果  在T细胞增殖实验中，经人肝癌细胞总RNA电转染的mDC比与人肝癌细胞总RNA混合的mDC激发T细胞的增殖能力增强（P<0.05）见表3。表3  T细胞增殖指数注：与实验1组相比*P<0.05

    3  讨论

    DC是目前已知功能最强的专职抗原呈递细胞[1]，在其分化发育过程中存在两个不同的阶段，作为未成熟的DC，具有摄取、处理抗原的能力并存在于全身淋巴组织中，一旦发育为成熟的DC，抗原捕获能力丧失，成为能激活静息T细胞、激发初始免疫反应的抗原呈递细胞[2，3]。GM?CSF的作用是使外周血单个核细胞向DC及巨噬细胞分化，IL?4的作用是抑制巨噬细胞的生成，而TNF?a的作用则是刺激DC成熟。

    我们将外周血单个核细胞先经GM?CSF及IL?4培养5～7d，大部分细胞悬浮生长，体积增大，有大量毛刺。此时再将人肝癌细胞总RNA电转染DC,使DC摄取外来抗原，同时加入TNF?a则促进DC成熟，增强其抗原呈递能力。我们选择人肝癌细胞总RNA作为转染物，其优势在于：（1）RNA半衰期短，只在宿主细胞的细胞质中表达，不会整合到DNA中，提高了临床应用的安全性。（2）在体外可通过PCR方法使RNA大量扩增，解决了人肝癌细胞来源量的问题。（3）RNA可诱导产生针对不同表位的多克隆的CD4+的辅助性T细胞和CD8+的细胞毒性T细胞的免疫反应[4]。

    在实验中，我们选择了电转染作为转染方式，其特点为：（1）电转染为一种纯物理方法，因此可避免化学性的和生物性的毒性。（2）应用范围广，可适用于各种类型的细胞[5]。（3）实验证明，其转染率较高[6]。（4）电转染会对imDC造成一定的损伤，如：细胞融合、细胞死亡等，但是绝大多数细胞可恢复到正常状态。（5）电转染不改变imDC原有蛋白的表达。

    本研究结果提示，利用单核细胞在体外经GM?CSF、IL?4和TNF?a的配伍作用可成功诱导出DC,后者可负载肿瘤细胞总RNA，在体外可有效激活T细胞，为临床上肝癌提供一种较为有效、方便的免疫方法。

【】
  1 Banchereau J,Briere F,Caux C,et al.Immunobiology of dendritic cells[J].Annu Rev Immunol,2006,18:767?811

2 黄竞荷，向军俭，杨红宇.抗肿瘤树突状细胞疫苗研究进展[J].病理生理杂志，2001,17（2）：165?169

3 Toungouz M,Lambermont M,Velu T,et al.Anti?tumour immunotherapy based on dendritic cells[J].J Soc Biol,2005,195(1):19?23

4 Van Tendeloo VF,Ponsaerts P,Lardon F,et al.Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells:superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells[J].Blood,2006,98(1):49?56

5 Sugden B,Marsh K,Yates J.A vector that replicates as a plasmid and can be efficiently selected in B?lymphoblasts transformed by Epstein?Barr virus[J].Mol Cell Biol,1985,5(2):410?413

6 Steinman RM,Inaba K,Turley S,et al.Antigen capture,processing,and presentation by dendritic cells:recent cell biological studies[J].Human Immunol,1999,60(7):562?567