丝裂霉素对人胃癌细胞超微结构和拓朴异构酶表达的影响
作者：白金君 蒋亚楠 孙黎 薄爱华
【摘要】 目的：探讨丝裂霉素对胃癌细胞拓朴异构酶Ⅱα（TOPOⅡα）表达的影响。方法：人胃癌细胞株BGC?823培养，加入丝裂霉素后5h和10h后采集细胞，进行光、电镜观察和免疫组化染色。结果：5h组形态变化不明显，胞核中TOPOⅡα含量减少；10h组，细胞器减少，质膜破裂，其胞质与胞核中TOPOⅡα表达明显减少。结论：丝裂霉素对BGC?823癌细胞有明显的杀伤作用，其途径之一可能与抑制TOPOⅡα基因表达有关。
【关键词】 丝裂霉素 胃肿瘤 免疫组织化学
【ABSTRACT】 Objective:To study the killing function of mitomycin(MMC) to gastric cancer cells and the expression of TopoⅡα.Methods:Human gastric cancer cellsBGC?823 was cultured,while MMC was added to culture continuously for 5 h or 10 h.Then the gastric cancer cells were observed under optical microscope and transmission electron microscope and stained with immunohistochemical method as well.Results:The morphology of gastric cancer cell was not changed significantly,but content of TopoⅡαin nuclear was reduced in the group for 5 hours.The changes in the group for 10 hours were as follows:the cell organ was obviously destroyed,the cell merabrane were burst,and the expression of TOPOⅡα was reduced significantly in cytoplasm and nuclear.Conclusion:Mitomyclin has killing fuction to gastric cancer cells,one of ways was to restrain the expression of TOPOⅡα gene.
【KEY WORDS】 Mitomycin,Stomach Neoplasms,Immunohistochemistry
丝裂霉素(Mitomycin,MMC)是一种广谱抗肿瘤药物，用来胃肠道恶性癌瘤、乳腺癌及肝癌等，其作用效果和用药方法临床已有报告[1]，而对其作用途径，尤其是它对重要酶系的影响，尚未见报告。本实验采用细胞培养技术,光、电镜观察方法和免疫组织化学技术，观察丝裂霉素对人源性胃癌细胞株(BGC?823)拓朴异构酶（TOPOⅡα）的影响，为探讨丝裂霉素的抗癌机制提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料 丝裂霉素注射液（Mitomycin of injection ）由浙江省海正药业股份有限公司生产；BGC?823胃癌细胞株由北京肿瘤研究所提供；二氧化碳培养箱和RPMI1640培养液由河北北方学院实验中心提供。
1.2 方法 将5×104浓度的BCG?823细胞接种于无菌6孔板中培养。在部分6孔板中加入无菌盖玻片，使癌细胞附壁生长（爬片）。另有部分6孔培养皿不加盖片，待癌细胞培养4h后，对照组不加入药物，实验组则向培养液中加入MMC 15μL(0.0075mg),继续培养爬片。分别加药后5h、10h后取出盖片，用4%多聚甲醛固定，常规洗涤和SP免疫组织化学染色。兔抗人TOPOⅡα血清由博士德公司购入，SP试剂盒及DAB显色剂由北京中杉金桥公司购入。其操作程序按试剂盒说明书进行。阴性对照PBS代替Ⅰ抗，阳性对照为已知人胃癌组织切片。
1.3 超薄切片及电镜观察 将加药后培养液于5h、10h分别离心，2%戊二醛固定。常规1%锇酸后固定，制成Epon812树酯块，超薄切片和铀?铅染色，JEM100CXⅡ透射电镜下观察摄像。
1.4 统计学处理 利用彩色图像分析仪软件进行图像分析。每组随机计数100个癌细胞，以灰度值表示着色深浅（深者灰度值低，浅者灰度值高）。借助SPSS软件进行方差分析，然后进行独立样本t检验。
2 结果
2.1 光、电镜下癌细胞形态变化 HE染色后光镜下可见对照组胃癌细胞呈多边形、梭形、不规则形，加药后5h组癌细胞外形无明显变化，仅表现有长突癌细胞减少；10h组大部分癌细胞破裂或细胞周边呈毛刺状，质膜不清或消失，可见细胞破损。电镜下可见5h组部分细胞肿胀细胞器减少;10h组，线粒体肿胀，嵴消失，细胞膜破裂或出现缺损，内质网扩张、附着核糖体和游离核糖体减少或消失，次级溶酶体增多，提示细胞代谢障碍。
2.2 免疫组化染色 TOPOⅡα阳性物质呈棕黄色或黄色，分布在癌细胞核与质中，因核内含量较多,用药5h组胞核与胞质阳性物质均减少，其灰度升高（表示着色浅），并与对照组有显著性差异（P<0.01）（见表1）。10h组生存细胞减少，只有生命力强代谢旺盛的部分细胞仍存活，所以这些细胞核中仍含TOPOⅡα，但是与对照组相比含量减少。部分癌细胞核质界线不明显，在破损细胞周边处有深染物（图1、2、3）。2008年8月白金君等：丝裂霉素对人胃癌细胞超微结构和拓朴异构酶表达的影响表1 TOPOⅡα在BGC?823胃癌细胞中表达灰度值
3 讨论
MMC是蒽环类抗癌抗生素类药物，是1956年日本学者若木重敏由轮生链霉菌培养液中提取的有效成分，呈紫色结晶状，其分子式为C15H18N4O5[2,3]。我国学者于1965年从江西土壤中分离出同样结构的抗肿瘤药物，命名为自力霉素。该抗生素含有烷化基团，临床上用于胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌和肠癌等化学。为细胞周期非特异性药物，对G1晚期和S早期细胞更为敏感。本实验表明MMC对癌细胞质膜性细胞器有直接损伤作用,本实验可见5h组少量细胞水肿，胞质密度降低。10h组大部分细胞呈现胞质空泡，主要是内质网扩张，其膜断裂所致；线粒体水肿、嵴减少或消失；核糖体、溶酶体等细胞器均减少或消失。说明MMC可以直接破坏癌细胞中主要细胞器，从而导致癌细胞代谢紊乱甚至死亡[4]。MMC在培养液中酸化被激活可以与DNA交叉连接，导致DNA链断裂，改变DNA中信息密码，抑制DNA复制，同时对RNA和蛋白质合成也有一定抑制作用[5]。
TOPOⅡα是较为重要的核酶[3],其分子量为17KD，它依赖ATP发挥酶活性作用。TOPOⅡα广泛存在于体细胞中,尤其在增殖活跃的细胞中呈高表达状态,它能够催化DNA形成连环、扭结或去扭结的双链DNA环,因此TOPOⅡα参与DNA复制、修补、重组、转录及染色体形成和分离等。这对细胞的生长、分裂过程至关重要[6～8]。TOPOⅡα的催化过程主要分４个过程：①酶识别结合到特异DNA序列上；②酶切开双链，然后TOPOⅡα又以共价键结合到断裂后产生的５′末端；③DNA双链片段横跃DNA主链切开的位点上（ATP结合）；④在切开位点上重新连成DNA双链。因此TOPOⅡα具有引导DNA复制的功能，它的作用涉及到核酸代谢的许多方面。TOPOⅡα目前已成为抗癌药物作用的主要靶点[9,10]。本试验表明，MMC作用５h后TOPOⅡα阳性的细胞核变浅（表达减弱，灰度值增大）。10h组TOPOⅡα在核中表达更弱，偶有细胞质边缘深染，其原因不明。MMC通过对TOPOⅡ基因的抑制作用，将进一步干扰DNA重接。
本实验表明MMC不仅可以直接破坏癌细胞膜性细胞器，而且能够通过干涉TOPOⅡα基因的活性而起到抗癌作用。因此临床医生对TOPOⅡα阳性的癌瘤患者如果采用TOPOⅡα抑制剂如蒽环类抗生素、二帖醌类化合物，均能击中TOPOⅡα靶点，导致癌细胞死亡，可达到良好的抗癌效果。
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