醋酸棉酚对雄性小鼠生育能力影响的实验研究
【摘要】 目的 探索醋酸棉酚对雄鼠生殖系统的影响，为生态灭鼠药的研制提供实验依据。方法 将雄性小鼠随机分成对照组和实验组，每组10只，通过灌胃的方法，对照组灌生理盐水，实验组按50、120、200 mg/kg体质量浓度灌胃，分别于灌胃10 d、20 d后解剖，取睾丸、附睾，进行精子细胞观察、精子计数、精子活率和精子形态观察，如指标有变化，进行交配试验检测醋酸棉酚对小鼠生育能力的影响。结果 灌胃10 d各指标组间差异均无显著性；20 d后，200 mg/kg组与对照组精子数目和睾丸系数变化差异有显著性（P<0.05），睾丸切片可见120 mg/kg和200 mg/kg组生精小管的初级精母细胞与精原细胞或基膜之间有较大的空隙，部分生精小管腔内的精子尾部减少。合笼后产子数量和怀孕率对照组与120 mg/kg组和200 mg/kg组差异有显著性（P<0.05），120 mg/kg组和200 mg/kg组间差异无显著性（P>0.05）。结论 醋酸棉酚对雄鼠生殖系统的影响可能与其浓度和药物作用的时间有关。50 mg/kg组在20 d内对小白鼠生育能力没有影响，120 mg/kg和200 mg/kg组在20 d内对小白鼠生育能力有影响。
【关键词】 醋酸棉酚 ； 避孕药 ； 生殖系统
Abstract:Objective To investigate the effect of gossypol acetate on reproductive systems of male mice, providing useful data for development of environment?friendly rat poison. Methods Male mice were randomly assigned into two groups, with 10 mice in each group. Mice in control group were administered intragastrically with the physiological saline, and mice in the experimental groups were administered intragastrically with gossypol acetate at the dose of 50,120,200 mg/kg. Epididymis were taken to observe the sperm counts, motility rate and the sperm shape after 10 days and 20 days respectively. In the case that diversified parameters were observed, mating test was conducted to detect the effects of gossypol acetate on fertility of male mice.Results There were no statistics significance between the experimental group and control group after 10 days, however, sperm counts and testicle/body weight indices had statistics significance (P<0.05) after 20 days.Thurdermore, there were visible difference between the groups administered with gossypol acetate at the doses of 120, 200 mg/kg and the control group in testicle section observation with microscopy. After having the birth ability test, number of baby mouse and pregnancy rates have statistic significance in the groups administered with gossypol acetate at the doses of 120 and 2 00 mg/kg groups. Conclusions The effect of gossypol acetate was possibly concerned with its concentration and the administration time. There was no effect in the group administered with gossypol acetate at the dose of 50 mg/kg in 20 days, but not in the group administered with gossypol acetate at the doses of 120 mg/kg and 200 mg/kg.
Key words:gossypol acetate; contraceptive; reproductive system
随着全球对环保的日益关注，人们在灭鼠理念上开始发生明显的转变，从杀死个体向控制种群和降低种群数量的角度转变，积极寻找、开发用于鼠类防治的抗生育剂是目前研究的新方向。醋酸棉酚是人类曾经广泛应用的男性避孕药。动物实验表明,棉酚药理作用机制是通过破坏雄性睾丸细精管的生精上皮细胞,从而导致精子数量的减少,直至无精子产生,停药后可恢复［1］。本研究利用醋酸棉酚的抗生育作用进行生态灭鼠药的研制。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物5周龄昆明小鼠，普通级，合格证号:SCXK(粤)2003?0002，粤监证字2006A017，28～30 g，雄性40只，雌性80只，购于广东省实验动物中心。
1.1.2药品复方醋酸棉酚片，每片含醋酸棉酚20 mg，国药准字H61022557，20 mg×3片×150盒。
1.1.3其他实验用品经高压灭菌的生理盐水，95％乙醇，10％甲醛，0.5％伊红染液，血细胞计数板，细胞计数器，天平，解剖工具及灌胃工具等。
1.2方法
1.2.1分组购回的小鼠正常饲养1周以适应实验的环境。1周后，实验小鼠随机分到实验组和对照组，其中实验组分为3个体质量浓度分别为200 mg/kg，120 mg/kg，50mg/kg，每组10只。
1.2.2灌胃实验灌胃前称出平均体质量，对照组灌生理盐水，实验组灌50 mg/kg ,120 mg/kg，200 mg/kg体质量浓度的醋酸棉酚混悬液，1周平均灌4次，每次0.3 mL，灌胃期间喂给正常饲料和水。分别于灌胃10 d、20 d后，从每组随机抽出4只小鼠脱臼处死，取睾丸和附睾，进行观察。
1.2.3附睾标本的制备颈椎脱臼法处死小鼠，取出两侧附睾，放入盛有1 mL生理盐水的小烧杯中，用眼科剪将附睾纵向剪1～2刀，静止3～5 min，轻轻摇动，用四层擦镜纸过滤。观察精子活率［2］、精子计数（1 000/精子计数）［2］、精子形态、精子细胞［3］等指标。
1.2.4睾丸切片的制备称出睾丸质量，将新鲜的睾丸标本放在φ=10％的甲醛中保存。制作切片时，先将标本于自来水冲洗30 min以上，再进行脱水、包埋、固定、切片、脱蜡、最后用HE染色。观察睾丸系数（睾丸质量/体质量）［4］和病理组织学变化。
1.2.5交配试验在灌胃20 d后，每组随机抽出4只雄鼠，进行合笼交配，期间喂给正常饲料和水。在合笼20 d后处死雌鼠，记录怀孕鼠数及孕鼠平均胎数。
1.3统计学方法用SPSS 10.0统计软件进行统计分析,采用方差分析,以P<0.05为差异有显著性。
2结 果
2.1观察指标单因素方差分析灌胃20 d后，对照组与实验组精子数目、睾丸系数变化差异有显著性。为了进一步了解方差分析差异的来源，两两比较结果显示精子数目、睾丸系数经过方差齐性检验，方差齐性（P=0.214； P=0.680）。选用Tukey HSD得200 mg/kg组精子数目和睾丸系数与对照组比较差异有显著性（P<0.05），见表1。
2.2交配试验
经非参数检验，对照组与实验组产子数量和怀孕率的差异有显著性。经两两比较，怀孕率对照组与120、200 mg/kg组差异均有显著性（P=0.015 和0.017），对照组与50 mg/kg差异无显著性（P=0.148），120 mg/kg组和200 mg/kg组差异无无显著性（P>0.05）；产子数量对照组与120 mg/kg、200 mg/kg组差异有显著性（P=0.026, 0.076）；50 mg/kg差异无显著性（P=1.000），120 mg/kg组和200 mg/kg组差异无显著性（P>0.05）,见表2， 3。
表1灌胃20 d后单因素方差分析表 略
表2对照组与实验组孕鼠的产子数量比较 略
表3对照组与实验组怀孕率比较 略
2.3睾丸切片观察
高倍镜下观察，NS组可见许多生精小管整齐的排列，各期精子细胞层次分明。间质细胞清晰可见，许多精原细胞紧贴于基膜上，可见许多染成粉红色的精子尾部游离于腔内。
120 mg/kg和200 mg/kg灌胃组灌胃20 d后，睾丸切片可见：部分生精小管排列较疏松，有些间质细胞消失，部分生精小管内基膜上的精原细胞较少，可见一些生精小管的初级精母细胞与精原细胞或基膜之间有较大的空隙，亦有部分生精小管腔内的精子尾部减少。50 mg/kg组未见异常，见图1。
图1小鼠睾丸切片(略)
3讨 论
3.1醋酸棉酚可致小鼠精子数目下降
棉酚的避孕原理是鼠类取食后，抑精作用通过对各级生殖细胞续贯作用的结果，使鼠类不能生成成熟的精子而不育，达到降低鼠类种群数量、减少鼠害的目的。大量研究证明，棉酚可抑制大鼠和人精子的数目、活率和活力［5］。本实验结果显示醋酸棉酚对雄性小鼠精子数目和睾丸系数组间差异有显著性，提示灌200 mg/kg体质量浓度的醋酸棉酚后，20 d小鼠的精子数目减少，初步显示了棉酚的抗生育作用。
3.2醋酸棉酚可致小鼠睾丸发生病理改变
本次睾丸切片可以看出，与生理盐水组比较，120 mg/kg体质量浓度已经发生生精小管内的精子细胞排列较疏松，少数腔内精子尾部减少，且精原细胞与初级精母细胞间有断层（出现较大空隙）。与孔佑华等［6］的研究结果一致。
3.3醋酸棉酚可致小鼠生育能力下降
在精子数目和睾丸系数发生变化的基础上，进行交配试验结果提示，醋酸棉酚可影响雌鼠怀孕率，降低雌鼠怀孕的几率，且影响怀孕鼠的胎数。本研究显示雄性小鼠用120 mg/kg醋酸棉酚灌胃20 d后，生育能力降低。
综上所述，醋酸棉酚可影响雄鼠的精子数目前使睾丸发生一定程度的病理改变，其作用的程度可能与药物的浓度及药物作用持续时间有关，120 mg/kg组20 d可影响小鼠生育能力。要达到灭鼠效果，还需要进一步进行更接近鼠类生活习惯的喂食对生育能力影响的研究。
致谢:本次实验得到李宇聪、张丽银、邓家艳、周文、汪洁、李宇政、廖少平、钟伟苑、曾雪红等同学的帮助，特此致谢。
【】
［1］ 曹坚,费仁仁,赵跃华,等.服用低剂量醋酸棉酚对正常男性精子碱性核蛋白的影响［J］.医学院学报,2000,22(3):220-222.
［2］ 熊立凡.临床检验基础［M］.3版. 北京：人民卫生出版社,2003:257-259.
［3］ 组织与胚胎学实验指导［M］.北京：科学技术文献出版社，2000，64.
［4］ 王心如.毒基础［M］.4版.人民卫生出版社，2003:119.
［5］ 全国男性节育药协作组.棉酚——一种新的男性抗生育制剂［J］.中华医学杂志，1978,4:417.
［6］ 孔佑华,王凤琴,张金萍,等.棉酚对小鼠睾丸生精细胞凋亡影响的实验研究［J］.济宁医学院学报,2003,3:42.
