韩氏针刺改善海洛因依赖大鼠学习记忆障碍和海马NOS、AchE的关系

【摘要】  目的 初步探讨韩氏针刺对海洛因依赖大鼠学习记忆的影响及其作用机制。方法 按逐日递增的原则皮下注射海洛因建立成瘾模型，利用Morris水迷宫测定大鼠成瘾后及针刺后学习记忆的变化，用蛋白定量考马斯亮兰法测定海马组织中一氧化氮合酶（NOS）和乙酰胆碱酯酶（AchE）活性。结果 ①Morris水迷宫定位航行实验中，成瘾组逃避潜伏期较对照组明显延长（P<0.05），而针刺组较成瘾组明显缩短（P<0.05）；空间探索实验中，成瘾组在第4象限搜索时间及120 s内跨越安全岛的次数较对照组明显下降（P<0.05），而针刺组较成瘾组明显增加(P<0.05)。②成瘾组海马组织中NOS和AchE活性高于对照组（P<0.05），针刺组明显低于成瘾组（P<0.05），而对照组和针刺组相比无明显差异。结论 韩氏针刺可以改善海洛因依赖大鼠学习记忆障碍，降低海洛因依赖引起的海马内NOS和AchE活性的增高。

【关键词】  海洛因依赖；一氧化氮合酶；乙酰胆碱酯酶；学习记忆；针刺；大鼠

    Abstract： Objective  To make a preliminary discussion of the effect of Han′s acupuncture stimulation on improving the learning and memory disorder of heroin-dependent rats and investigate its potential mechanisms. Methods  Animal model of drug addiction was established by subcutaneous injection of heroin in rats twice a day for 9 days, according to the principle of increasing daily dose. The ability of special learning and memory was assessed with Morris Water Maze behavioral test for the changes from addiction to the improvement by acupuncture treatment. Total protein quantification kit (Coomassie brilliant blue) was used to detect the activity of nitric oxide synthase (NOS) and AchE in rat hippocampus. Results  ①Compared with the Control group, the mean escape latency in place navigation of the Model group was markedly prolonged (P<0.05), while that in the Acupuncture group was shortened noticeably compared with the Model group (P<0.05). In space probe test, the mean exploring time of the fourth quadrant and the times of crossing the island within 120 s of the Model group markedly decreased, compared with the Control group (P<0.05), while those of the Acupuncture group markedly increased, compared with the Model group (P<0.05). ②The activity of the NOS and AchE in rat hippocampus of the Model group was higher than the Control group (P<0.05), while that of the Acupuncture group was lower than the Model group (P<0.05), there was no obvious difference between the Control and the Acupuncture groups, though. Conclusion  Han′s acupuncture stimulation can improve the ability of the learning and memory of heroin-dependent rats and decrease the activity of NOS and AchE in hippocampus induced by heroin addiction.

    大量资料证明：海洛因依赖可导致学习记忆能力减退，但学习记忆同时又被证明在成瘾行为的形成和保持中发挥着重要作用。而海洛因依赖中枢机制作为解决临床预防和治疗的关键，至今仍不清楚。本实验试图通过建立海洛因的成瘾模型并对其进行韩氏针刺治疗仪的戒断治疗，从行为学及分子学方面研究韩氏针刺对成瘾学习记忆的影响，初步探讨其作用机制。

    1  材料和方法

    1.1  实验动物  健康SD大鼠30只（由重庆第三军医大学实验动物中心提供），雌雄不拘，体重（200±20）g，适应喂养1周后开始造模。

    1.2  主要仪器  Morris水迷宫(成都泰盟公司)；BI2000图像分析系统（成都泰盟公司）；LH－402型韩氏穴位神经刺激仪（北京力普康医药科技公司）。

    1.3  药品和试剂  海洛因（纯度61.84%,贵州省公安厅提供），盐酸纳洛酮注射液（湖南益侨制药有限公司），NOS测定试剂盒、AchE测定试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

    1.4  方法

    1.4.1  动物模型建立  SD大鼠按逐日递增连续皮下注射海洛因9天，首日剂量3 mg/kg，2次/d（第9天剂量达到27 mg/kg），对照组按同样方式注射等量生理盐水。第10天，对照组和成瘾组各取5只，腹腔注射纳洛酮5 mg/kg，诱发戒断症状（戒断症状包括：湿狗样抖、扭体、伸展、理毛、齿颤、吞咽、直立等），观察30 min，记录它们的次数，并根据［1］进行戒断评分，与已建立的海洛因依赖大鼠模型戒断标准比较，确定建模成功。

    1.4.2  动物分组  随机分为对照组、成瘾组和针刺组，每组10只。成瘾组、针刺组确定模型成功建立后，给予海洛因维持剂量27 mg/kg，1次/d。2天后，30只大鼠同时进行水迷宫成绩测定，成瘾组和对照组大鼠麻醉处死，取海马组织进行NOS及AchE活性测定；而针刺组大鼠进行韩氏针刺仪戒断治疗5天（期间不给予海洛因维持剂量）后，再次进行水迷宫成绩测定，之后亦麻醉处死，取海马组织进行NOS及AchE活性测定。

    1.4.3  Morris水迷宫测试  Morris水迷宫包括定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验历时4天，每天上下午定时各训练1次，检测大鼠找到安全岛的时间（逃避潜伏期），逃避潜伏期越长，其学习记忆能力越差，否则越强。第5天撤除安全岛作空间探索实验，将大鼠从同一入水点放入水中，记录120 s内大鼠跨越安全岛的次数及在原安全岛所在象限的搜索时间，相同时间内跨越安全岛次数越少或在原安全岛所在象限搜索时间越短，则其学习记忆能力越差，否则越强。

    1.4.4  治疗方法  使用韩氏针刺穴位治疗仪，将其经皮电针刺激改为不锈钢针皮下刺入。针刺组大鼠经乙醚吸入麻醉后，四肢稍加固定，仰卧位于鼠板上，参照大鼠常用的针灸穴位［2］选取双侧的“足三里”（胫骨前结节外侧2 mm处）和“三阴交”（胫骨后内踝上部2 mm处）两穴位，分别插入1对不锈钢针，刺激频率为2 Hz/100 Hz，刺激强度按1-2-3mA递增，每一强度持续10 min，共电针30 min［3］。每日1次，均在上午10点左右进行，连续治疗5天。

    1.4.5  标本采集及检测  大鼠经25%氨基甲酸乙酯（1.0～1.2 g/kg）腹腔注射麻醉。断头剥取脑组织，在冰盘上取出完整海马，置于冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸吸干，天平称重，按1∶10（每克组织中加10 ml冷生理盐水）加生理盐水，眼科剪剪碎后，用超声粉碎机制成10%组织匀浆（匀浆过程始终处于冰水中），低温低速离心机3000 r/min离心15 min，将离心好的匀浆取上清液，弃沉淀。采用考马斯亮兰测定法测定组织中蛋白含量，应用分光光度法测定组织中NOS和AchE含量，组织匀浆中所测物质含量以实测值与总蛋白比值表示。具体操作均按试剂盒说明书进行。

    1.5  统计学处理  实验数据用SPSS 13.0统计软件统计。所有数据以±s表示。组间比较采用单因素方差分析，方差齐，采用t检验，否则采用秩和检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  行为学检测结果

    2.1.1  定位航行实验  成瘾组逃避潜伏期较对照组明显延长（P<0.05），而针刺组与成瘾组相比明显缩短（P<0.05）（表1）。 表1  对照组、成瘾组和针刺组大鼠定位航行实验中逃避潜伏期的比较与对照组比较：#P<0.05；与成瘾组比较：*P<0.05

    2.1.2  空间探索实验  空间探索实验中，成瘾组在第4象限120 s内跨越安全岛的次数及在第4象限的搜索时间较对照组明显下降(P<0.05)；而针刺组较成瘾组明显增加(P<0.05)（表2）。表2  3组大鼠在空间探索实验中的情况比较与对照组比较：#P<0.05；与成瘾组比较：*P<0.05

    2.2  各组大鼠海马组织中NOS、AchE活性测定  成瘾组海马组织中AchE及NOS活性较对照组明显升高(P<0.05)；而针刺组海马组织中二者活性与非针刺组相比明显下降(P<0.05)（表3）。说明韩氏针刺可有效下调海马AchE活性，增加Ach含量,恢复坏死的神经元，改善学习记忆能力障碍。表3  3组大鼠海马组织中NOS和AchE活性的比较 与对照组比较：#P<0.05，与成瘾组比较：*P<0.05

    3  讨  论

    已有研究证明［4］海洛因成瘾不仅会降低人的学习记忆能力，且戒断时会出现一系列的戒断症状，而电针刺激可促使中枢神经系统释放内源性阿片肽；并有临床研究证明临床上使用韩氏穴位神经刺激仪连续冶疗，可以缓解海洛因成瘾患者的戒断症状。那么韩氏针刺是否可同时改善成瘾患者的学习记忆能力呢？本实验通过建立海洛因成瘾大鼠模型，并对其进行针刺、行为学测定和海马组织中NOS和AchE活性的测定。结果显示：韩氏针刺可以一定程度地改善海洛因成瘾大鼠学习记忆能力，其作用与海马组织中NOS和AchE活性的变化有一定关系。

    乙酰胆碱（Ach）与学习记忆等大脑高级神经功能有关，学习记忆任务的完成伴随着脑内 Ach的变化。Ach由胆碱乙酰化酶（ChAT）合成，AchE分解，通过Ach受体发挥生物学功能。由于Ach性质极不稳定，容易水解，极难准确测定其含量，而AchE是Ach的

降解酶,测定脑组织中AchE的活性，可判断脑内Ach含量的变化［5］。另外，学习记忆的减退与NO及NOS的增高密切相关。NO在体内是一种自由基性质的气体, 具有脂溶性, 可快速透过生物膜扩散, 达到邻近靶细胞发挥作用, 其结构简单又极不稳定, 生物半衰期短, 易扩散且反应性强。NO在体内是由NOS催化L-精氨酸（L-Arg）和氧产生的。但NO是一种可以与氧化阴离子产生过氧化亚硝酸的自由基，过氧化亚硝酸是另一种具有强破坏作用的自由基，产生活化的氧化物可以诱导强烈的氧化应激反应导致脂类的过氧化并且改变蛋白的DNA的功能，最终导致神经元死亡［6］。现已阐明，阿片类药物可以通过阿片受体介导对中枢神经系统中NOS活性产生影响。因此，检测中枢神经系统NOS活性，间接反映NO含量，有助于了解阿片成瘾的形成机制以及与学习记忆之间的关系。

    本实验表明韩氏针刺能明显改善海洛因依赖大鼠学习记忆障碍，其可能的机制是：下调海马组织 AchE活性，减慢Ach的降解过程，提高Ach的含量，延缓中枢胆碱能神经元的受损，改善海洛因依赖大鼠学习记忆能力。另外一种可能性：韩氏针刺通过刺激“足三里”和“三阴交”两穴位，可以增加中枢神经系统阿片肽的释放，在改善戒断症状的同时，释放的阿片类物质可以降低神经组织包括海马组织内的NOS活性，减少NO的合成，从而减少其神经毒性。

    本实验结果有助于阐明韩氏针刺治疗海洛因戒断的中枢机制，并为临床治疗海洛因成瘾者的戒断症状提供了新的理论依据。

【】
  ［1］ 叶晓明,王新华,由振东.海洛因依赖大鼠模型的建立［J］.第二军医大学学报,2000,21(1):95.

［2］ 林文注.实验针灸学［M］.上海:上海技术出版社,1994：286.

［3］ 崔彩莲,马勤耘,吴鎏桢,等. 2/100 Hz 电针抑制吗啡戒断大鼠中枢神经元型一氧化氮合酶的表达［J］.北京大学学报,2002,34(4):321-325.

［4］ 刘胜,周文华,刘惠芬，等.针灸“肾俞”穴对吗啡依赖大鼠戒断反应和成瘾脑区神经元活动的影响［J］.针灸,2004,24(11):805-809.

［5］ Kobayashi MS,Han D, Pa cke L. Antioxidants and herbal extract s prote ct HT-4 neuronal Cells against glutamate-induced cytotoxicity ［J］. Free Radic Res,2000,32(2):115-214.

［6］ 李国君,吴德生.中枢神经系统中一氧化氮和一氧化氮合酶研究进展［J］.国外医学·卫生学分册,1999,26(2):65-68,77.