异氟醚对大鼠脑缺血/再灌注诱导c-Jun磷酸化的影响

                       作者：温相如，关秋华，苗蓓，张光毅

【摘要】  目的 观察大鼠脑缺血/再灌注后c-Jun蛋白磷酸化情况以及异氟醚对其的影响。方法 四动脉结扎法建立大鼠脑缺血模型。随机分为假手术组、直接脑缺血/再灌注组、吸入2 h 1.5 MAC异氟醚脑缺血/再灌注组和吸入纯氧2 h脑缺血/再灌注组, 全脑缺血15 min后分别再灌注6 h。再灌注6 h的大鼠进行磷酸化c-Jun（p-c-Jun）的免疫印迹和免疫组化检测。结果 缺血前吸入1.5 MAC异氟醚组大鼠的c-Jun磷酸化水平明显低于直接脑缺血/再灌注组和吸入纯氧2 h脑缺血/再灌注组（P<0.05）。结论 异氟醚抑制c-Jun蛋白的磷酸化可能是其对大鼠缺血/再灌注性脑损伤产生保护作用的机制之一。

【关键词】  脑；缺血/再灌注损伤；异氟醚；

    Abstract: Objective  To observe the focal cerebral ischemia/reperfusion-induced phosphorylation of c-Jun in rats and investigate the effect of isoflurane. Methods  Animal model of global cerebral ischemia was established by ligation of bilateral common carotid and vertebral arteries (four vessels). Healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: sham operation group (S), ischemia/reperfusion group (I/R), 2 h 1.5 MAC isoflurane preconditioning+ischemia/reperfusion group (I/R+Iso) and 2 h pure O2 inhalation+ischemia/reperfusion group (I/R+O2). 15 min after global cerebral ischemia, the rats were allowed 6 hours of reperfusion. Determination of phosphorylation of c-Jun was performed by Western blotting and immunohistochemistry. Results  The phosphorylation levels of c-Jun in I/R+Iso group was markedly lower than that in I/R and I/R+O2 groups (P<0.05). Conclusion  Isoflurane is able to inhibit the phosphorylation of c-Jun, which might be one of its protective mechanisms in the ischemia/reperfusion-induced brain injuries in rats.

    近年的研究表明，吸入性麻醉剂异氟醚（Iso）能明显延长缺血/再灌注（I/R）性脑损伤的神经系统和组织的能量输出，对缺血/再灌注性脑损伤具有明显的保护作用［1］，但并没有阐明其保护作用的分子机制。一般认为,脑缺血/再灌注可引起脑神经细胞凋亡及相关基因的表达,异氟醚可能是通过影响细胞凋亡过程中相关因子或蛋白的表达,对缺血/再灌注性脑损伤起保护作用。有表明磷酸化c-Jun（p-c-Jun）与缺血/再灌注性脑损伤密切相关［2］，p-c-Jun是JNK信号通路的活性底物,JNK激酶磷酸化其特异性底物c-Jun核转录因子,p-c-Jun进入核内形成AP-1进而影响基因的表达调控［3-4］,其表达程度反映了脑缺血后神经元死亡或凋亡的程度［5］。本实验拟通过异氟醚预处理全脑缺血/再灌注的大鼠模型，研究异氟醚对p-c-Jun的影响，以期探寻异氟醚神经保护作用的分子机制。

    1  材料和方法

    1.1  实验动物及材料  清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重250～300 g，徐州医学院实验动物中心提供。异氟醚由日本Dinabot公司提供；一抗（anti-p-c-Jun和anti-c-Jun）由Santa Cruz公司提供；二抗（羊抗兔）和标准牛血清白蛋白购自美国Sigma公司；醋酸纤维膜（NC膜）为Amersham Biosciences公司产品；NBT/BCIP为Promega公司产品；其他试剂为国产分析纯。电动匀浆器购自美国Glas-Col公司；Z252MK台式高速冷冻离心机购自德国HERMLE公司；凝胶图像分析处理系统（LabWorks）购自UVP Inc.(Upland,CA,USA)。

    1.2  大鼠四动脉阻断全脑缺血模型  按Pulsinelli等［6］方法进行。水合氯醛麻醉大鼠，分离双侧颈总动脉，挂线备用，然后用电凝针电凝双侧椎动脉。手术第2天，在大鼠清醒状态下，游离出双侧颈总动脉，用动脉夹阻断血流，缺血15 min，缺血时保持大鼠直肠温度于36.5～37.5℃（温度计测试，取暖设备保温）。以体征表现判断缺血模型的可靠性，具体表现为：瞳孔放大；四肢僵直，有摸爬动作，但不能爬起；尾巴僵硬；呼吸加快。

    1.3  动物分组及处理  随机分为4组（n=10）：①Sham组，仅手术处理，不进行缺血/再灌注；②脑缺血/再灌注组（I/R组）；③吸入纯氧缺血/再灌注组（O2I/R组），缺血前20 min吸纯氧2 h；④吸入1.5 MAC异氟醚缺血/再灌注组（IsoI/R组），缺血前20 min吸入1.5 MAC的异氟醚2 h。各组术后再灌注6 h。

    1.4  样品制备

    1.4.1  蛋白测定样品  再灌注6 h后，各组取大鼠5只断头处死，快速取脑，分离双侧海马，沿海马裂将CA1区组织分离出来，置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行：从液氮中取出海马加0.8 ml匀浆缓冲液，用电动匀浆器高速匀浆（10 s×12次），4℃下800 g离心15 min，移弃上清液；在沉淀中加入0.5 ml的匀浆缓冲液A洗一次，4℃下1000 g离心15 min后，弃上清；留沉淀再加0.5 ml的匀浆缓冲液B于4℃下摇匀30 min，4℃下12000 g离心15 min后，移取上清液作为核抽提产物。测蛋白后分装，置-80℃冰箱待用。

    1.4.2  免疫组化样品  各组大鼠5只，经腹腔注射水合氯醛麻醉后，开左胸暴露心脏，将针头自心尖穿过左心室插入主动脉，先用38℃左右生理盐水约100 ml快速灌洗，然后复灌入冰冷的4%多聚甲醛250～300 ml，30 min内灌完，灌注后的大鼠断头取脑，用4%多聚甲醛后固定12 h左右。流水冲洗，冲洗时间同固定时间。然后70%（4 h）、80%(4 h)、90%(4 h)、95%(2 h×2次)、100%(2 h×2次)梯度乙醇脱水，二甲苯透明（1.5 h）、60℃浸蜡（1 h×3次）。取出包埋，4℃保存。

    1.5  检测方法

    1.5.1  蛋白含量测定  按Lowry等方法，以牛血清白蛋白为标准蛋白。

    1.5.2  免疫印迹法  上述样品（50 μg/L）经SDS-PAGE分离后，以半干转法转移至NC膜，室温封闭4 h(1%BSA,pH 7.5的10 mmol/L Tris，10 mmol/L的NaCl，0.1%Tween20)，加入一抗，4℃过夜。用洗涤液洗膜，加入相应二抗，37℃保温2 h，封闭液洗膜。以NBT/BCIP显色，水洗终止反应。图像处理仪分析免疫印迹的灰度。

    1.5.3  免疫组化法  样品切片，常规二甲苯脱蜡，100%～70%梯度乙醇浸水，先用0.3% H2O2室温作用6～8 min，消除内源性辣根过氧化物酶活性，接着浸入配制好的柠檬酸/柠檬酸钠中，95℃水浴15 min。PBS洗后用血清封闭，室温1 h后PBS洗3遍，上一抗置于4℃ 48～72 h。弃一抗，PBS洗3遍。以后的操作按VectABC试剂盒进行，PBS洗4遍，最后DAB显色，镜检控制结果。然后梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封片，光镜下观察。

    1.6  统计学处理  数据以±s表示，2组间数据比较采用新复极差法，多组间数据比较采用单因素方差分析（AZOVA）,P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  大鼠脑缺血/再灌注后海马CA1区锥体细胞核中p-c-Jun免疫印迹分析  I/R组p-c-Jun水平明显升高；O2I/R组p-c-Jun水平与I/R组类似；IsoI/R组与I/R组、O2I/R组相比较，p-c-Jun水平明显降低（P<0.05）。c-Jun的表达在脑缺血/再灌注过程中均有升高，异氟醚预处理对c-Jun的表达没有影响（图1、表1）。表1  各组免疫印迹灰度值比较（与Sham组比较的倍数）

    2.2  大鼠脑缺血/再灌注后海马CA1区锥体细胞核中p-c-Jun免疫组化分析  Sham组细胞胞核中p-c-Jun的免疫反应很弱；I/R组细胞胞核中p-c-Jun的免疫反应性明显增强；O2I/R组p-c-Jun的免疫反应性与I/R组相似；IsoI/R组与I/R组、O2I/R组相比较，p-c-Jun的免疫反应性明显降低。见图2。

    3  讨  论

    在脑缺血/再灌注过程中，细胞凋亡是多种途径共同参与的结果，线粒体途径通过从线粒体释放细胞色素c，激活caspase-3导致细胞凋亡；细胞核途径则通过激活MAPK家族成员，如JNK等，进一步通过调控核内转录因子活性和相关基因的表达,促进细胞凋亡［7］。JNK是一类丝氨酸/苏氨酸激酶,也称应激活化蛋白激酶(SAPK)，可被多种促进凋亡发生的刺激所激活。一般认为,c-Jun是JNK信号通路的底物，JNK激酶磷酸化其特异性底物c-Jun核转录因子并导致AP-1转录活性增强，从而促进了许多凋亡蛋白的表达，如FasL［8］，这是细胞凋亡JNK信号通路核凋亡通路。本实验中我们采用免疫印迹法观察到脑缺血/再灌注后大鼠海马CA1区p-c-Jun出现最高峰，经吸入性麻醉药异氟醚干预后，可以显著抑制c-Jun的磷酸化，从而减轻脑缺血性损伤。

    临床上缺血/再灌注性脑损伤非常常见，而且这种脑损伤一旦启动将发生级联反应,造成器官的严重不可逆损伤。近年的研究显示,吸入性麻醉药异氟醚对缺血/再灌注性脑损伤有一定的保护作用；而且吸入麻醉药预处理,不易引起组织缺血,没有发生血栓的风险,便于在临床上安全实施，但其作用机制还不十分清楚。也有研究表明异氟醚预处理诱导的脑缺血耐受性是依赖KATP通道的激活和一氧化氮合酶激活［9］。

    本实验用免疫印迹法观察JNK介导的核通路中的p-c-Jun的变化,发现异氟醚可以抑制JNK的底物c-Jun的磷酸化，提示异氟醚抗脑缺血/再灌注损伤的机制可能与JNK介导的核通路有关。

【】
  ［1］ Sakai H, Sheng H, Yates RB, et al. Isoflurane provides long-term protection against focal cerebral ischemia in the rat ［J］. Anesthesiology,2007,106(1):92-99.

［2］ Guan QH, Pei DS, Zong YY, et al. Neuroprotection against ischemic brain injury by a small peptide inhibitor of c-Jun N-terminal kinase (JNK) via nuclear and non-nuclear pathways ［J］. Neuroscience，2006,139(2):609-627.

［3］ Ogasawara A, Arakawa T, Kaneda T, et al. Fluid shear stress-induced cyclooxygenase-2 expression is mediated by C/EBP beta, cAMP-response element-binding protein, and AP-1 in osteoblastic MC3T3-E1 cells ［J］. J Biol Chem,2001,276(10):7048-7054.

［4］ Davis RJ. Signal transduction by the JNK group of MAP kinases ［J］. Cell,2000,103(2):239-252.

［5］ 方芳,陈晓春,朱元贵，等.JNK的激活在 MPP+诱导SHSY5Y细胞凋亡的信号传导中的作用［J］.病理生理杂志,2003,19(2):198-202.

［6］ Pulsinelli WA, Brierley JB. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat ［J］. Stroke，1979,10(3):267-272.

［7］ Zhang F, Yin W, Chen J. Apoptosis in cerebral ischemia: executional and regulatory signaling mechanisms ［J］. Neurol Res,2004,26(8):835-845.

［8］ Faris M, Latinis KM, Kempiak SJ, et al. Stress-induced Fas ligand expression in T cells is mediated through a MEK kinase 1-regulated response element in the Fas ligand promoter ［J］. Mol Cell Biol,1998,18(9):5414-5424.

［9］ Xiong L, Zheng Y, Wu M, et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats ［J］. Anesth Analg,2003,96(1):233-237.