坎地沙坦对豚鼠心房肌细胞钾通道电流的影响

                   作者：周美丽　柳茵　刘维军　李琳　张爱元　康白

　　【摘要】 目的 研究坎地沙坦对正常豚鼠心房肌细胞内向整流钾电流(I_k1)和延迟整流钾电流(I_k)的影响，旨在为临床上应用坎地沙坦预防房颤发作和复发提供理论依据。方法 酶解法分离豚鼠单个心房肌细胞，应用全细胞膜片嵌技术，在不同嵌制条件下，记录并分析坎地沙坦对豚鼠单个心房肌细胞I_k1及I_k的影响。结果 坎地沙坦对I_K1无影响，但可明显抑制I_k。结论 坎地沙坦抑制I_k，使动作电位时程(APD)和有效不应期(ERP)延长，改善房颤电重构及它的现在已明确的抑制结构重构的作用共同参与房颤发作和复发预防的机制。?
　　【关键词】坎地沙坦；豚鼠；心房肌细胞；钾通道；膜片嵌技术??
　　
　　【Abstract】 Objective To study the efects of candesatan on delayed rectifier K⁺current and inward current k+current in guinea pig cardiac atrium myocytes.Methods Whole-cell patch-clamp technique was used.Results Candesatan had no effects on I_k1I_k was inhibited by candesatan(from 0．95±0．04pA/pF to 0．45±0．03)pA/pF,n=5,P<0．05).Conclusion Candesatan inhibitingI_k might be goodness to blocking electrical remodeling in atrial fibrillation.?
　　【Key words】Candesatan；Guinea pigs；Cardiac atrium myocytes；Potassium channels；Patchclamp techniques
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　　血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)诞生于上世纪九十年代，一直以来，被广泛应用于高血压及相关靶器官的保护，目前一系列临床实验结果均提示血管紧张素II受体拮抗剂可预防房颤的发生和复发^[1，2]，但具体机制尚不清楚。有研究报道，血管紧张素Ⅱ对心肌细胞的电生理作用是通过受体影响离子通道活性而实现的^[3]，坎地沙坦是一种选择性血管紧张素Ⅱ亚型I受体(AT1)阻断药，本研究采用膜片钳全细胞记录方法观察它对延迟整流钾通道电流(I_k)及对内向整流钾通道电流(I_K1)的影响,探讨坎地沙坦对心肌细胞电生理作用的机制，从而为坎地沙坦应用于临床预防房颤发生和复发提供理论依据。?
　　1 材料与方法?
　　1．1 实验动物 健康成熟豚鼠，雌雄均可，体质量200~250 g，由山东医科大学实验动物中心提供。?
　　1．2 药品和试剂 EGTA、HEPES购自Amresco公司，EGTA Na₂-ATP、小牛血清蛋白(BSA)为Sigma产品，胶原酶Ⅱ购于invitrogen公司，实验药物坎地沙坦纯粉由黄海制药厂惠赠，其余为国产分离纯。?
　　1．3 液体组成(单位均为mmol/L) ①正常台氏液：NaCl 135，KCl 5．4．HEPES 10，NaH₂ PO₄ 0．33，MgCl₂ 1．0，CaCl₂ 1．8，葡萄糖10(用NaOH调pH至7．35~7．38);②无钙台氏液：NaCl 135，KCl 5．4．HEPES 10，NaH₂ PO₄ 0．33，MgCl₂ 1．0,葡萄糖10(用NaOH调pH至7．35~7．38);③记录I_k的电极内液：KCl 140，HEPES 5，EGTA 10，Na₂-ATP 2．0，MgCl₂ 1．0(用KOH调pH至7．3)；④记录I_k1的电极内液：KCl 140，Na₂ATP 2．0，HEPES 5．0，MgCl₂ 1．0，EGTA 10(用KOH调pH至7．3);⑤记录钾电流的电极外液：NaCl 135，
　　KCl 5．4，MgCl₂ 1．0,CaCl₂ 1．0，NaH₂ PO₄0．33，葡萄糖5．0，HEPES 5．0．CaCl₂ 0．2(用KOH调PH至7．35~7．38)。?
　　1．4 豚鼠单个心房肌细胞的分离 采用Langendorff灌流酶解分离法。选健康成年豚鼠，腹腔注射3％戊巴比妥钠 1 mg/kg，并注射肝素200 U/kg，麻醉约5~10 min，仰卧位固定后，开胸暴露心脏,把
　　4℃无钙台氏液滴在心脏上,以降低其氧耗。剪开心包,取出心脏,置于4℃无钙台氏液中,清洗并游离主动脉根部，然后迅速将心脏悬挂于Langendorff装置上用动脉夹固定，行主动脉逆行灌注，灌流速度为5~10 ml/min，依次灌无钙台氏液、含0．03胶原酶(Collagenase II．Sigma)的低钙(25 μmol/L)台氏液、KB液。以无钙台氏液灌流?5~7? min后，换以含牛血清白蛋白(BSA，0．02%)和胶原酶(II型，0．02 g/L)的低钙台氏液灌流2~5 min。待心脏膨松变大，呈海绵状，心肌呈粉红色半透明，流出液为黏条状时，取下心脏，剪去心室，其他部分置于37℃的KB液中保存5~10 min后剪成碎块，并用粗吸管缓慢吹打使之分散成单个心房肌细胞。用200 μm的微孔尼龙网过滤去除结缔组织和未消化细胞，滤液重新置于KB液中保存，于室温下静止1 h并复钙以备用。灌流系统保持在37℃，所有液体均充以纯氧饱和。?
　　在倒置显微镜(Nikon Diaphot 300)下可见单个心房肌细胞呈矩形和杆状，横纹清楚。复钙后部分心肌细胞有自发性收缩，短时间内挛缩成团块状死亡细胞，而大部分呈静息状态可供做实验用。?

　　1．5 膜片嵌全细胞记录 将复钙后的细胞悬液滴在灌流槽中,置于倒置显微镜(Olympus,LX70)工作台上,待细胞贴壁后以电极外液灌流,选取贴壁牢固、无自主收缩、横纹清晰及边缘光滑透亮的细胞进行试验。三维操纵器(Narishige,日本)移动电极,轻压到细胞表面,负压抽吸,形成1~4 GΩ高阻封接,补偿电容电流和电极串联电阻后,形成全细胞记录形式。信号经Ag/AgCl 电极引导,经膜片钳放大器(EPC-9，HEKA)放大,由机通过软件经数模和模数转换卡进行脉冲发放和数据采集,数据存放于硬盘并进行数据分析。?
　　1．6 统计学方法 采用SPSS 13．0软件作统计学处理，实验结果均以（x±s）表示，采用自身对照t检验，分析给药前后离子电流的变化。P>0．05无统计学意义，P<0．05为统计学有显著性差异。?
　　2 结果?
　　2．1 坎地沙坦对豚鼠心房肌细胞I_k1的影响 记录I_k1时细胞外液加入CaCl₂ 0．2 mmol/L 阻断钙电流。钳制电压-40 mV,可消除钠电流的影响。实验电压从-120mV 以10 mV 为步阶跃至+50 mV,时程300 ms,频率0．2 kHz。得到一系列稳态电流,超极化时为内向电流,电流幅值较大,去极化时该电流转为外向,具有很强的内向整流特性(图1)。坎地沙坦(0．1 uM)作用10 min后，超级化和去极化状态下，I_K1电流密度有所降低，但无统计学意义。?
　　
　　2．2 坎地沙坦对豚鼠心房肌细胞I_k的影响 为了阻断Ca²⁺通道，以含CaCl₂的细胞外液灌流，钳制电压-4o mV~+70 mV、阶跃为10 mV，脉冲保持时间5 s，诱发出I_k，以去极化至+70 mV时的K峰值为观察指标。坎地沙坦(0．1 uM)作用10 min后，I_k电流密度由用药前(0．95±0．04)pA/pF降至(0．45±0．03)pA/pF(n=5，P<0．05)，如图2所示。
　　
　　3 讨论?
　　现在普遍认为，心房电重构和结构重构是房颤发生和维持的主要机制。?
　　3．1 坎地沙坦改善心房电重构 新近研究发现，坎地沙坦能够防止持续3 h心房快速起搏导致的犬AERP的缩短^[4]，但具体机制不明确。房颤时心房不应期(ERP)和动作电位时限(APD)缩短，相应的反映了离子通道水平的变化。延迟整流钾电流是参与心肌细胞2、3期复极的主要电流，它包括快速延迟整流钾电流（Ikr）、缓慢延迟整流钾电流（Iks）和超快速延迟整流钾电流（Ikur）。而RP流钾电流2001年时，曾有人发现坎地沙坦对克隆的人钾通道有不同程度的抑制作用；本试验也发现坎地沙坦对I_K1无明显作用，但可显著抑制I_k，推测坎地沙坦可能通过抑制I_k延长APD和ERP，影响房颤时的ERP缩短，改善心房电重构。?
　　3．2 坎地沙坦改善心房结构重构 当房颤转复为窦性心律后，心房电重构可完全恢复，但心房结构重构仍持续存在^[5]；房颤转律后用坎地沙坦可预防其复发的大量临床实验表明，坎地沙坦除了改善电重构外还改善结构重构。Nakashima等^[6]发现坎地沙坦不能阻止持续超过7 d心房快速起搏犬AERP减小和不应期频率适应性降低，但能够通过抑制心房肌纤维化，防止心房结构重构，降低心房快速起搏犬AF诱发率和持续时间就是个证据。房颤时，发生结构重构的机制可能是，在人类ATⅡ受体分为两种亚型，AT1 和AT2受体，房颤发生时，血管紧张素Ⅱ增多，与血管紧张素1型受体结合后具有很强的促纤维化作用，引起心房的肥厚和纤维化。病研究也发现，心房间质纤维化是房颤患者心房结构重构最突出的表现^[7]。从房颤结构重构的可能发生机制，笔者可推论坎地沙坦预防房颤转复后复发的可能机制，坎地沙坦是一新型血管紧张素II受体抑制剂，特异性地作用于血管紧张紊Ⅱ受体AT1亚型，对AT2受体无影响，抑制AT1受体与血管紧张素II结合，从而抑制心房间质纤维化，改善结构重构。?
　　总之,阻断心房重构，成为房颤的新靶点。AngⅡ和房颤关系密切，在房颤心房重构发生中的作用已逐步得到认识。越来越多的实验证据表明，坎地沙坦作为一种选择性血管紧张素Ⅱ亚型I受体(AT1)阻断药，可抑制房颤心房重构，预防房颤的发作和复发，它有望在以后成为房颤治疗的常规药物。?
　　
　　
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　　［6］ Kumagai K,Nakashima H,Urata H,et al.Effects of angiotensin Ⅱtype receptor antagonist on electrical and structural remodeling in atrial fibrillation.J Am Coll Cardiol,2003,41(12)：2197-2204.?
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