辛伐他汀对SH-SY5Y神经细胞中胆碱能神经系统的刺激作用
【摘要】 目的： 研究胆固醇降解药辛伐他汀（Simivastatin）对SH-SY5Y神经细胞中胆碱能神经的刺激作用，探讨史他汀类药物在神经退变性疾病中的神经性保护机制。方法： 体外培养SH-SY5Y神经细胞（源于人神经母细胞瘤细胞），在培养液中加入辛伐他汀培养48 h，然后用比色法测定细胞MTT还原率及胆碱酯酶活性，用蛋白印迹方法测定尼古丁受体α7和α3蛋白水平，RT-PCR方法测定该类受体mRNA表达水平。结果： 辛伐他汀能降低培养细胞中乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性（分别降低41.9%和18.1%）；增强尼古丁受体α7亚单位的蛋白和mRNA表达水平（分别升高 23% 和 32%），但对α3无明显影响。结论： 辛伐他汀可以刺激胆碱能神经系统，可能具有神经性保护作用。
【关键词】 辛伐他汀； 胆碱酯酶类； 尼古丁受体； SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞
［Abstract］ Objective: To investigate the effect of simivastatin on cholinergic nerve system and to understand neuroprotective mechanisms of the drug in neurodegenerative diseases. Methods: SH-SY5Y cells (human neuroblastoma cell line), were incubated with simivastatin for 48 hr. The MTT reduction and cholinesterase activity were measured by using photometric method; the expressions of nicotinic acetylcholine receptor (nAChR)subunits α7 and α3 at protein and mRNA levels were detected with Western blotting and RT-PCR techniques respectively. Results: Simivastatin inhibited the activities of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase by 41.9% and 18.1%, respectively, in the cultured cells. The drug increased the expressions of nAChR α7 at both protein and mRNA levels by 23% and 32%, respectively; however, it dose not induce any changes in the expression of nAChR α3. Conclusions: Simivastatin can stimulate the cholinergic nervous system and may play certain neuroprotective effects.
［Key words］ Simivastatin; cholinesterases; receptors, nicotine; SH-SY5Y cells
史他汀类药在临床主要用于降低体内胆固醇水平，高血压病。近年的研究表明，胆固醇水平升高和代谢改变与神经退变性疾病（如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病）的发生有密切的关系[1]。β淀粉样蛋白是阿尔茨海默病发病机制中的关键物质之一。已发现高胆固醇可增强β分泌酶的活性，使β淀粉样蛋白前体蛋白分解产生β淀粉样蛋白增多；降低胆固醇水平可使α分解酶活性增强，而减少β淀粉样蛋白的生成[2]。史他汀类药物通过降低胆固醇合成来缓解阿尔茨海默病的发生率；另外，史他汀类药物还通过非胆固醇依赖性的作用来发挥作用，但其在阿尔茨海默病发病中的神经保护作用机制仍不十分清楚[3]。为此，本研究用体外培养的神经细胞，研究辛伐他汀（Smivastatin，史他汀类药物的一种类型）的神经保护作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
源于人脑的神经母细胞瘤细胞株 (SH-SY5Y细胞）购于 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures公司（德国），辛伐他汀购于Pfizer Laboratories公司 （美国），尼古丁受体α7和α3亚单位引物由瑞典Gen Bank Accession公司合成，羊抗α7和α3、鼠抗β-肌动蛋白（β-actin ）多克隆抗体及辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的抗羊及抗鼠二抗购自Santa Cruz Biotechnology Inc（美国）；D-MEM培养液购自Gibco Introvagen 公司（英国），胆碱酯酶测定试剂硫代乙酰胆碱（ATC）、硫代丁酰胆碱(BTC)、5，5’-联硫代-双-2-硝基苯甲酸（DTNB）、BW284C51（AChE的抑制剂）、iso-OMPA（BuChE的抑制剂），均购自Sigma公司；RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒购自Ambion公司。
1.2 细胞培养和处理
用含有15%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的D-MEM培养液培养SH-SY5Y细胞，培养箱中含5% CO2，温度为37 ℃。在含SH-SY5Y细胞的培养液中加入不同浓度的辛伐他汀，培养期为48 h。
1.3 测定方法
MTT 测定：用比色法测定MTT [3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazoliumbromide]水平，以此反映细胞的损伤程度和功能状况[4]。用Ellman比色法测定胆碱酯酶活性[5]。参照Guan 等[6]的方法提取细胞蛋白并定量，用蛋白质印迹 （Western blotting）方法检测尼古丁受体α7和α3亚单位蛋白表达水平。细胞RNA按总RNA提取试剂盒说明书提取，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法测定尼古丁受体α7和α3亚单位的mRNA水平，步骤和PCR循环条件Hellstrom-Lindahl等[7]的方法。尼古丁受体α7和α3亚单位mRNA的引物序列见表1。表1 尼古丁受体α7和α3亚单位mRNA的引物序列（略）
1.4 统计学处理
结果用两因素析因设计资料的方差分析方法和成组设计资料的 t 检验方法进行处理，P<0.05或P<0.01表示差异有显著性或高度显著性意义。
2 结果
2.1 细胞存活率
结果显示，用不同浓度辛伐他汀（0.01~100 μmol/L）处理SH-SY5Y细胞，大剂量（10 μmol/L以上）可引起MTT还原率百分比降低（图1），适量浓度不损伤神经细胞，因而选择0.1 μmol/L辛伐他汀作为处理体外培养神经细胞的适宜浓度。
2．2 胆碱酯酶活性
用0.1 μmol/L辛伐他汀处理培养细胞后，乙酰胆碱酯酶活性和丁酰胆碱酯酶活性均较正常对照组分别降低41.9%和18.1%（表2）。表2 经辛伐他汀处理后SH-SY5Y神经细胞中胆碱酯酶活性（略）注：与对照组相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01。
2.3 尼古丁受体α7和α3亚单位蛋白和mRNA水平
用辛伐他汀处理培养细胞后，尼古丁受体α7亚单位蛋白水平较正常对照组升高 23% （图2A），而尼古丁受体α3亚单位蛋白（图2B）则无明显改变。从图3A 可以看出，尼古丁受体α7和α3亚单位mRNA分离效果较好，与设计的管家基因（Cyclophiline）分离区别清楚；与对照组相比（图3B），尼古丁受体α7亚单位mRNA水平明显升高32%，而尼古丁受体α3亚单位mRNA水平则无明显改变。
3 讨论
阿尔茨海默病（AD）是一种严重影响老年人健康的神经退变性疾病，临床上主要表现为记忆力逐渐降低、识认功能障碍，是痴呆症的主要类型，其主要发生机制与β-淀粉样蛋白在脑组织中大量沉积有关[8]。β淀粉样蛋白是通过β-分泌酶和γ-分泌酶切割β淀粉样蛋白前质蛋白（APP）所产生。近年来大量的研究表明，高胆固醇可增强β淀粉样蛋白前质蛋白代谢过程中β-分泌酶的活性，使 APP分解产生β-淀粉样蛋白增多。
体内的胆固醇通过甲羟戊酸通路进行合成，该合成通路中的限速酶是羟甲戊二酰辅酶A还原酶。目前认为，史他汀类药物可通过抑制甲羟戊酸通路中羟甲戊二酰辅酶A还原酶的活性来抑制胆固醇的合成，达到血管性疾病的目的。近年来的研究发现，由于降低胆固醇可减少APP代谢过程中β-淀粉样蛋白的生成，对AD有治疗作用[9]。另一方面，史他汀类药也可通过非胆固醇依赖性作用机制来达到缓解AD症状的目的[10]。研究表明，史他汀本身就有增强APP 代谢中α-分泌酶的作用，使β-分泌酶的作用减弱，从而减少β淀粉样蛋白生成。
神经型尼古丁受体是第二信使非依赖性、门控性离子通道受体，既可与神经性递质结合，本身亦是离子通道，其通道开放不需第二信使的参与。α7尼古丁受体亚型和 α4β2 尼古丁受体亚型是脑组织中神经型尼古丁受体的主要类型，在AD发病机制中起着重要的作用[10]。当前，α7尼古丁受体亚型受到了越来越多的重视，该受体亚型除了与大脑学习、记忆和识认功能密切相关外，还有明显的神经保护性作用，与β-淀粉样蛋白的作用机制也有一定的联系。
胆碱能系统在记忆的形成和维护中起着重要作用，胆碱酯酶也与AD的发病密切相关，胆碱酯酶的水解底物乙酰胆碱缺失的严重程度与痴呆程度相一致。大量的研究发现，在AD病人脑组织中，总胆碱酯酶活性降低；然而在老年斑及其周围脑组织中胆碱酯酶活性却是升高的，这也是导致AD病病理改变的重要因素[5]。目前世界上AD最为成熟的治疗方法是采用胆碱酯酶抑制剂来降低患者脑内胆碱酯酶的水平，提升神经递质乙酰胆碱的水平，补偿胆碱能功能的缺失。我们的研究发现，用辛伐他汀处理体外培养的神经细胞后，可明显降低细胞乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性，表明辛伐他汀有助于提高脑组织中乙酰胆碱及丁酰胆碱含量，有助于增强胆碱能神经系统的功能。
我们过去的研究中用洛伐他汀（Lovastatin，史他汀类药物之一）处理体外培养的PC12神经细胞，发现洛伐他汀使细胞中125I标记的α-金蛇环毒素配体与α7尼古丁受体结合密度升高，增强α-7尼古丁受体mRNA表达水平，对抗β-淀粉样蛋白引起的脂质过氧化[11]。本次研究中，使用另一种史他汀类药物——辛伐他汀处理SH-SY5Y神经细胞后，观察到辛伐他汀对α7尼古丁受体亦有上调作用，表现为α7尼古丁受体蛋白水平和mRNA表达水平均明显升高。结果表明，辛伐他汀能降低培养细胞中乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性，使尼古丁受体α7亚单位蛋白和mRNA表达增强，表明辛伐他汀通过降低胆碱酯酶的活性，减少乙酰胆碱的分解，刺激胆碱能系统，上调α7神经型尼古丁受体，具有一定的神经性保护作用。
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