依达拉奉预处理离体乳鼠脑皮质细胞对脑缺血再灌注损伤的保护作用

【摘要】  　　目的： 探讨不同浓度依达拉奉预处理离体乳鼠脑皮质细胞对脑缺血-再灌注损伤的保护作用。方法： 取出生24 h以内的新生SD乳鼠的脑皮质细胞,体外培养至第7天，随机分为5组：A组（正常对照组）；B组（药物损伤组）；C1组（50 μmol/L依达拉奉预处理组）；C2 组（100 μmol/L依达拉奉预处理组）；C3组(200 μmol/L依达拉奉预处理组)。C1、 C2 、C3组第7天用依达拉奉预处理，24 h后B、 C1 、C2、 C3组予200 μmol/L谷氨酸损伤0.5 h，所有组换正常培养液继续培养24 h后观察神经细胞存活率（MTT法）、乳酸脱氢酶（LDH）漏出率、细胞凋亡率和HE染色后倒置相差显微镜下细胞形态变化。结果： 依达拉奉预处理各组MTT含量不同程度高于损伤组，LDH漏出量和凋亡细胞百分比不同程度低于损伤组，倒置相差显微镜下见预处理组细胞形态受损较药物损伤组轻，3个预处理组以C2、C3组效果明显，但两组差别无统计学意义。结论： 采用所测浓度的依达拉奉提前24 h预处理离体幼鼠脑皮质细胞，对脑缺血-再灌注损伤有明显的保护作用。

【关键词】  依达拉奉; 脑缺血； 缺血预处理； 细胞凋亡； 乳酸脱氢酶; 再灌注损伤

　　［Abstract］ Objective: To study the protective effect of edaravone pretreatment against cerebral ischemia-reperfusion caused injury in cultured cortical cells of suckling rat brain. Methods： Cortical cells of SD rat within 24 hours after birth were cultured for 7 days, and then were randomly divided into 5 groups: group A (control group), group B (ischemia-reperfusion group), groups C1, C2, and C3 (edaravone pretreatment groups, 50umol/L for group C1,  100umol/L for group C2, 200 μmol/L for group C3). After cells in groups C1, C2, and C3 were treated by corresponding dosages of edaravone for 24 hours, glutamate (200 μmol/L) was added into culturing media of groups B, C1, C2, and C3. In half an hour later, culture media of all groups were substituted by fresh normal medium. After another 24 hours, cortical cell survival rates, LDH efflux rates and cell apoptosis rates were determined, and the cell morphous was observed with the help of HE staining. Results： The survival rates were higher, and the LDH efflux rates and apoptosis rates were lower in edaravone groups than those of group B; The cell destruction in edaravone treated groups was lighter than that in group B. The protective results of groups C2 and C3 was obvious, and there was no significant difference between the 2 groups. Conclusions： The pretreatment of edaravone with the tested concentrations in 24 hours before has obvious protective effect to cultured cortical cells against the cerebral ischemia-reperfusion caused injury;

　　［Key words］ edaravone; brain ischemia; ischemic preconditioning; apoptosis; lactate dehydrogenase; reperfusion injury

    脑血管疾病是我国人群致死的第三大因素,是首位致残疾病，且发病率呈逐年上升趋势，其中缺血性脑血管病占绝大部分，缺血性脑血管病尤其是脑缺血后的再灌注损伤危害极大。预处理是近20年研究减轻缺血再灌注损伤的途径之一，它先后经历了缺血预处理、化学预处理、药物预处理的过程，因药物预处理具有相对安全、使用方便、易控制等优点，与其它预处理方法比较具有潜在的临床应用价值，成为研究保护缺血再灌注损伤的一种新途径和发展趋势。2007年5月～10月通过培养乳鼠脑皮质细胞，用不同浓度的依达拉奉提前24 h对其进行预处理，谷氨酸制作缺血再灌注损伤模型，观察不同浓度的依达拉奉对缺血脑细胞的保护效果
 
　　1  材料和方法

　　1.1  材料

　　新生SD乳鼠（出生24 h内）由贵阳医学院实验动物中心提供；DMEM/F12培养基（HyClone公司,美国），标准胎牛血清（天津市海洋生物制品科技有限公司），异丙酚（北京费森尤斯卡比医药有限公司），依达拉奉（南京先声东元制药有限公司），即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒 （武汉博士德生物工程有限公司），LDH测试盒（南京建成生物工程研究所第一分所），MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（凯基生物科技发展有限公司）。

　　1.2  乳鼠大脑皮层神经细胞原代培养取出生后1 d之内的新生SD乳鼠,碘酒和75%的酒精消毒皮肤后取双侧大脑皮质,剔除软脑膜和血管，D-hank′s液冲洗两遍，用眼科剪剪成1 mm3左右的块状，终浓度0.125%胰蛋白酶常温下消化3~5 min,边消化边用巴士管吹打，至肉眼看不到细胞团块，立刻用培养基终止消化，200目筛网过滤成单细胞悬液，细胞计数板计数；加培养基适量，调细胞浓度为105~106/L的细胞悬液，接种于96孔培养板、24孔培养板、盖玻片、50 ml培养瓶中。置37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，第3天用含2.5 μg/L阿糖胞苷[1]培养基换液,抑制神经胶质细胞及纤维细胞生长，第6天用培养基换液，准备大脑皮质神经细胞鉴定和实验分组。

　　1.3  实验分组随机分为5组：A组（正常对照组），B组（药物损伤组），C1组（50 μmol/L依达拉奉预处理组），C2 组（100 μmol/L依达拉奉预处理组）和C3组(200 μmol/L依达拉奉预处理组)。

　　1.4  大脑皮质神经细胞鉴定大脑皮质细胞体外培养至第7天,取出24孔培养板内的盖玻片，参照即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒说明书操作，然后观察。

　　1.5  药物预处理脑皮质细胞体外培养至第7天，C1组、C2组、C3组去掉原培养基,分别加入50 μmol/L依达拉奉培养基、100 μmol/L依达拉奉培养基、200 μmol/L依达拉奉培养基，继续培养24 h。

　　1.6  谷氨酸（Glu）毒性神经细胞损伤模型建立培养8 d的皮层神经细胞去掉原培养基,B组、C1组、C2 组、C3组加入含Glu的无血清培养基(Glu终浓度200 μmol/L)作用0.5 h，D-Hank′s冲洗两遍后,各组均换含10%胎牛血清的 DMEM/F-12培养基,继续培养24 h。

　　1.7  指标检测（细胞生长至第9天）

　　1.7.1  MTT法测定神经细胞存活率 

　　将接种细胞的96孔板，每孔加50 μl×MTT,在37℃孵育4 h，使MTT还原成甲月赞，吸出上清液，每孔加150 μl二甲基亚砜（DMSO）使甲月赞溶解，轻轻震荡，使其充分溶解，酶标仪在550 nm波长处检测每孔的光吸收值（OD），减去本底OD值，然后按下式细胞存活率：细胞存活率=（加药组细胞OD值/对照组细胞OD）×100%。

　　1.7.2  LDH漏出率的测定

　　24孔培养板吸取每孔培养液，参照试剂盒说明书测定各孔中OD值；留下的24孔培养板，加培养液，其量与吸取量相同，用力吹打，显微镜下见细胞基本无存活，参照试剂盒说明书测定各孔中OD值。根据公式计算LDH漏出率[2]，细胞培养液LDH漏出率=培养液LDH的OD值/（培养液LDH的OD值+细胞匀浆液LDH的OD值）×100%。

　　1.7.3  细胞凋亡率 

　　将各组细胞消化离心后收集于离心管,制成单细胞悬液,按凋亡试剂盒要求加入试剂,6 h内用流式细胞仪上检测凋亡。

　　1.7.4  HE染色 

　　倒置相差显微镜下观察神经细胞的形态学变化。

　　1.8  统计学处理  

　　量化指标以（x±s）表示，分析组间差异显著性用SPSS13.0统计软件进行方差分析和q检验，P＜0.05表明有显著性差异。

　　2  结果

　　2.1  大脑皮质神经细胞鉴定细胞生长至第7天，进行神经元特异烯醇化酶（NSE）免疫组织化学染色，阳性着色为棕黄色。本实验反应呈阳性，说明所培养细胞是脑皮质细胞（如图1）。

　　2.2  神经细胞存活率、LDH漏出率、凋亡率正常对照组与损伤组比较P＜0.01；C1组与损伤组比较P＞0.05，C2 组、C3组与损伤组比较P<0.05或 P<0.01；C2与C3组比较P＞0.05，见表1。表1  各组神经细胞存活率、LDH漏出率、细胞凋亡率比较（略）注：与正常对照组相比，(1)P＜0.01；与药物损伤组相比，(2)P＞0.05，(3)P＜0.05，(4)P＜0.01；两组相比，(5)P＞0.05。

　　2.3  细胞形态HE染色显示，正常生长9 d的神经元突起明显，并交织成网状，胞体较大，多数细胞呈锥体型，双极型、三极型多见,偶见单极型；圆形,折光性强,有明显立体感,突起增粗并出现末端分支。Glu处理后神经细胞明显损伤,大部分细胞胞体变小，突起皱缩、减少甚至消失、折光性减弱,细胞核破碎、部分细胞甚至溶解,但仍有少数细胞保持正常形态。依达拉奉预处理组神经细胞形态与药物损伤组相比细胞损伤程度较轻。见图2、3、4、5、6。

　　3  讨论    

　　缺血再灌注损伤是一个复杂的病理过程，是多因素交互起作用的，兴奋性氨基酸大量释放学说是缺血再灌注损伤机制比较公认的学说之一，本试验用谷氨酸建立缺血再灌注损伤细胞模型。结果显示损伤组的细胞存活率明显下降、凋亡率明显上升、LDH漏出率明显增高。HE染色观察Glu酸损伤组神经细胞受损非常严重，可能与下列机制有关。（1）缺血后兴奋性氨基酸介导大量Na+,Cl-及H2O内流，造成细胞水肿坏死;（2）激活N-甲基D-门冬氨酸受体（NMDAR），NMDAR激活后可以破坏细胞内外K+的平衡从而诱导细胞凋亡[3]，K+外流发生兴奋性突触后电位可激活细胞内的钙离子依赖性蛋白、 降解E等，使神经元脂膜、细胞骨架蛋白、核酸等重要结构解体。NMDAR激活后可介导Ca2+大量内流，导致细胞内Ca2+超载，激发一系列瀑布样病理生理过程，导致神经元的迟发性死亡[4]。本研究结果证实了Glu终浓度200 μmol/L作用30 min，可成功建立离体幼鼠脑皮质细胞缺血再灌注损伤模型，证实大量释放学说的可能性。选择50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L提前24 h预处理离体脑皮质细胞，观察不同浓度的依达拉奉的脑保护效果。结果显示： 50 μmol/L依达拉奉预处理组与损伤组比较，神经细胞存活率、LDH漏出率、神经细胞凋亡率变化无统计学意义（P＞0.05），说明该浓度依达拉奉对细胞保护作用并不明显。100 μmol/L依达拉奉预处理组和200 μmol/L依达拉奉预处理组与损伤组比较，细胞存活率上升，LDH漏出率、神经细胞凋亡率下降（P<0.05或P<0.01）；而这两用药组之间比较无统计学意义，提示可能随浓度增加，其保护作用增强，但最佳浓度有待进一步探索；HE染色两组细胞形态受损较轻。依达拉奉的脑保护作用与其清除自由基的功能相关。依达拉奉是第一个具有明确作用机制的自由基清除剂，它是一个亲脂性基团，血脑屏障的通透率为60％[5,6]，这为脑保护提供了结构基础。依达拉奉在体内的正常解离常数下游离出一个质子（4号位），成为依达拉奉阴离子，该变得比较活跃，在有自由基的情况下，极易失去该电子，与自由基的不配对电子配对，使自由基失去活性。脑缺血再灌注时可以产生大量自由基，如O2-和OH-，依达拉奉可以与O2-和OH-等相互作用，形成稳定的氧化产物OPB(2-氧-3-苯腙丁酸)，通过清除自由基、抑制细胞膜的脂质过氧化，达到稳定神经细胞膜、抑制神经细胞坏死和凋亡的保护作用。另有动物实验证明，依达拉奉可以通过另一个途径，即保护内质网机能障碍[7]，来达到保护神经的缺血缺氧损伤，提示同时还可采用透视电镜观察内质网的形态变化。 本实验提示，用50 μmol/L依达拉奉提前24 h预处理离体乳鼠脑皮质细胞对脑缺血-再灌注损伤无明显的保护作用；用100 μmol/L、200 μmol/L依达拉奉提前24 h预处理离体乳鼠脑皮质细胞对脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用，这为临床用药提供了一定的，但因实验样本量及观察指标有限，尚需进一步研究。

【参考】
  　　[1]罗湘颖,杨志敏,王廷华，等.胎鼠大脑皮质神经元的体外培养及鉴定[J].神经解剖学杂志，2004（5）：505-506.

　　[2]洪庆涛,宋岳涛,唐一鹏，等.细胞培养液乳酸脱氢酶漏出率的比色测定及其应用[J].细胞生物学杂志，2004（1）89-91.

　　[3]Yu SP,Yeh C,Strasser U, et al. NMDA receptormediated K+ effinx and neuronala potosis [J].Science,1999(5412):336-339.

　　[4]Nakayamar,Yano T,U shijimak,et al.Effects of dantrolene on extracellular glutamate concentration and neuronal death in the rat hippocampal CA1 region subjected to transient ischemia [J].Anesthesiology,2002(3):705-710.

　　[5]Takamatsu Y, Yuki S, Watanabe T. Studies on the concentration of 3-meth1-1-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one (MCI-186) in MCA occlusion and reperfusion model of rats [J].Jpn Pharmacol　Ther,1997(25):1785-1791.

　　[6]Otomo E. Effect of a novel free radical scavenger, edaravone (MCI-186), on acute brain infarction. randomized, placebo-controlled, double-blind study at multicenters[J]. Cerebrovasc Dis,2003(3):222-229.

　　[7]Qi X, Okuma Y, Hosoi T, et al. Edaravone protects against hypoxia/ischemia-inducede　ndoplasmicr eticulum dysfunction[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2004(1): 388-393.