谷氨酰胺对缺血再灌注肝脏热休克蛋白70基因表达的影响

              作者：刘国平，冯晓东，朱闻溪，杨广顺，周文平，程广明  

【摘要】  目的 探讨谷氨酰胺（Gln）对缺血再灌注肝脏热休克蛋白70（HSP70）基因表达的影响及其对肝脏的保护作用。方法 雄性Wistar大鼠120只，随机分为3组（n＝40）：假手术组（1组）、生理盐水组（2组）和谷氨酰胺组（3组）。术前3组大鼠连续5天腹腔注射Gln，2组仅给予等量的生理盐水。2、3组采用Pringle's法阻断入肝血流，35 分钟后开放复流，1组仅行麻醉、开腹。分别于阻断前及再灌注后2、4、24小时，取血及肝组织，测定血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肿瘤坏死因子?α（TNF?α）及肝组织丙二醛（MDA）的含量，采用RT?PCR法检测肝组织HSP70mRNA的表达。结果 再灌注后2、4、24小时，3组MDA、ALT、AST、LDH及TNF?α水平与2组相比均显著降低（P<0.05），而3组肝组织HSP70mRNA表达显著高于2组和1组（P<0.05）。结论 Gln能够促进肝组织HSP70基因的表达，减轻肝缺血再灌注损伤，抑制炎症因子释放。

【关键词】  热休克蛋白70；谷氨酰胺；缺血再灌注；肝脏

    Abstract：  Objective  To investigate the influence of L?glutamine on the expression of  HSP70mRNA  in liver and its protective role against ischemia/reperfusion damage.Methods  One hundred and twenty male Wistar rats were divided randomly to three groups(n=40): sham?operation group (group 1),saline group(group 2) and glutamine group (group 3).Rats in group 2 were pretreated with 4ml 0.9% saline intraperitonally twice per day for 5 days consecutively.In group 3,rats were pretreated with Gln dissolved in 4ml 0.9% saline intraperitoneally twice per day for 5 days consecutively.The rats of groups 2 and 3 underwent total hepatic inflow occlusion for 35min utes through the pringle′s method.Ten rats from each group were randomly chosen and killed before the initiation of occlusion and at 2hours,4hours,24hours after reperfusion respectively.The levels of MDA in liver tissue were measured.The levels of serum TNF?α were detected.The serum concentrations of ALT,AST,LDH were assayed on a standard biochemistry autoanalyser.The expression levels of HSP70mRNA in hepatic tissue were assessed by reverse transcription polymerase chain reaction.Results  Compared with group 2,the levels of MDA,ALT,AST,LDH and TNF?α in group 3 decreased significantly at 2hours,4hours,24hours after reperfusion (P<0.05).The levels of HSP70mRNA expression in liver from group 3 were higher than those from group 1 and group 2 at 2hours,4hours,24hours after reperfusion(P<0.05).Conclusion  Gln presupplement could alleviate  the ischemia/reperfusion injury of liver and inhibit the release of proinflammatory factors after the pringle′s method,which might be related with the role of Gln in promoting the expression of HSP70mRNA.

    Key words:HSP70;L?glutamine;ischemia reperfusion;liver

     通过启动内源性保护反应来增强肝脏本身的耐受性，是减轻缺血再灌注损伤最理想的方法。热休克蛋白（HSP）是一种细胞自我保护性蛋白，促进HSP表达是启动内源性保护反应的关键所在。目前，对于预防性应用谷氨酰胺（Gln）是否可促进HSP70表达和减轻机体继发性损害报告甚少，且存在着争议［1-3］。其作用机制如何也不明确。因此，本研究拟探讨Gln对缺血再灌注肝脏HSP70基因表达的影响及其作用。

    材料与方法

    1  实验动物分组及处理

    雄性Wistar大鼠120只，体重300～350g ,随机分为3组（n=40）：（1）假手术组（1组）；（2）生理盐水组（2组）：生理盐水4ml，腹腔注射，每天2次，连续5天；（3）谷氨酰胺组（3组）：Gln溶液（300mg/kg，用生理盐水稀释至4ml），腹腔注射，每天2次，连续5天。术前禁食12小时，自由饮水。所有动物均采用戊巴比妥钠（3.5mg/100g）腹腔内注射进行麻醉。沿腹正中切口切开腹腔，显露第1肝门，采用Pringle's法用无创血管夹阻断肝十二指肠韧带，持续35分钟后，撤夹恢复血流。分别于缺血前及再灌注后2、4、24小时每组随机选取10只大鼠，自心脏取血5ml,静置20分钟，4000r/min离心10分钟，分离血清，-30℃保存待测。切取部分肝组织，置于-70℃中保存待测。1组除麻醉、开腹外不做任何处理。血清用于测定谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）及肿瘤坏死因子?α（TNF?α），肝组织用于丙二醛（MDA）及HSP70mRNA表达的测定。

    2  主要试剂

    L?Gln(上海康达氨基酸厂)；MDA及总蛋白定量试剂（双缩脲）（南京建成生物研究所），试剂配置序号参照说明书；TNF?α采用夹心法ELISA检测试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)测定；大鼠HSP70引物参照Genebank［TaKaRa（大连）公司合成］序列为（扩增片段为354bp）：5’?AACGTGCTGCGGATCATCAA?3’（上游引物）,5’?CTGGATGGACGTGTAGAAGT?3’（下游引物）；内参照磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物［TaKaRa（大连）公司合成］序列为（扩增片段为528bp）：5’?ACCACCATGGAGAAGGCCGG?3’（上游引物）,5’?CTCAGTGTAGCCCAGGATGC?3’（下游引物） ；Trizol总RNA提取试剂（美国Promega公司）；逆转录试剂盒、DNA Market(M)及PCR扩增所需的其他试剂［TaKaRa（大连）公司］；电泳用聚丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷（Tris）及琼脂糖等（上海化工生物工程公司）。

    3  检测方法

    血清ALT、AST、LDH含量采用岛津CL?7150全自动生化分析仪测定；血清TNF?α、肝脏MDA含量分别采用ELISA方法、硫代巴比妥酸法测定，操作步骤按试剂盒说明书进行；每组在各个时点分别随机选取5只大鼠的肝标本，采用RT?PCR法检测肝组织HSP70mRNA的表达。

    4  统计学处理

    数据结果均以均值±标准差表示，统计学差异性检验采用SPSS11.5统计软件进行完全随机设计方差分析，样本之间采用LSD法进行两两比较。

      结  果

    1  血清ALT、LDH、AST水平的变化

    再灌注后2、4、24小时，3组ALT、LDH、AST水平明显低于2组（P<0.05）；2组则明显高于1组（P<0.05）（见表1）。

    2  肝组织MDA水平的变化

    再灌注后2、4、24小时，3组肝组织MDA水平明显低于2组（P<0.05）。再灌注后2、4小时,2组MDA水平明显高于1组（P<0.05），但再灌注后24小时两组之间无显著差异。与1组相比2组MDA水平明显增高（P<0.05）（见表1）。

    3  血清TNF?α水平的变化

    再灌注后2、4、24小时，3组TNF?α水平明显低于2组（P<0.05）；2、3组则明显高于1组（P<0.05）（见表1）。

    4  各组大鼠肝组织HSP70mRNA表达的变化

    术前：1、2组肝脏未见HSP70mRNA表达，而3组明显表达（P<0.05）。再灌注后2、4、24小时：1组肝脏HSP70mRNA表达微弱，2组表达稍增强（P<0.05）， 3组表达显著高于2组和1组（P<0.05）（见表2、图1）。

　　讨  论

    HSP是细胞应激蛋白的一种，细胞在受到急性非致死性刺激后，HSP基因即刻被激活，转录活性增强，细胞内可检测出mRNA表达［4］，这最早发现于热休克实验中的果蝇唾液腺细胞中，后来证明，它是一种普遍存在于生物界中的能被多种损伤因素和应激因子诱导的细胞应激反应蛋白。HSP根据分子量不同而命名为HSP70、HSP90、HSP27等。对于哺乳动物，HSP70是其中重要的活性成分，它可以被各种物理、化学、生物等刺激所诱导，产生非特异性保护作用。这是因为HSP70作为一种“分子伴侣”，可使应激损害所造成的变性蛋白质重新正确折叠得以修复，或指导它们进一步降解，防止在细胞内积聚而致细胞损伤。

    尽管许多方法和药物可诱导HSP产生，但在临床实际中，由于受到剂量、毒副作用、诱导效率等许多条件的限制而得不到应用。本研究结果显示预防性给予Gln，肝脏HSP70mRNA表达水平明显提高。这表明Gln具有促进HSP70基因转录的效应。在缺血再灌注损伤中HSP具有保护作用，其机制可能与下列因素有关：（1）抑制中性粒细胞浸润［5］；（2）调节白细胞与内皮细胞间的相互作用［6］；（3）提高细胞的抗氧化能力［7］；（4）减少炎性介质的生成［8］,如TNF?α等；（5）HSP70还可能调节NO的生成［9］。本研究发现在肝脏缺血再灌注前预防性给予Gln，可减轻再灌注后的脂质过氧化损伤，降低转氨酶水平，抑制TNF?α的释放，说明Gln在肝缺血再灌注损伤中起保护作用,这可能与Gln促进HSP70mRNA的表达关系密切。因为Gln是一种人体正常需要的氨基酸，对人体无毒，临床中已广泛应用。所以，在缺血再灌注前给予Gln诱导HSP70以提高机体自身的耐受性，对减轻肝脏损伤，减少并发症，改善预后具有积极的临床意义。

    目前对于Gln诱导HSP还存在着争议［1-3］，各研究结果之间的差异可能与Gln的剂量、应用时间、所作用的组织及动物种属有关。关于Gln诱导HSP的机制仍不清楚，该效应是由Gln本身还是其代谢产物作用的结果，仍有待深入研究。

【】
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