基因工程在生物柴油原料中的应用研究

　　许多学者研究了ACCase不同亚基在脂肪酸合成中的作用。Alisa等克隆和表达了油棕β-羧基转移酶基因(accD)和生物素羧化酶基因(accC),研究表明accD基因的表达在维持异质型ACCase的水平及植物种子的含油量中起着最重要的作用。这个研究也首次证明了高水平accD基因的表达,会产生高水平的含油量[15]。此外,Madoka等[16]、Kode等[17]分别采用超量表达和基因敲除技术方法研究了accD基因,结果显示accD基因编码的β-CT亚基是ACCase的限制因子。
　　对于含油微藻乙酰辅酶A羧化酶的研究比较少,Dunahay等[18]首次报道了含叶绿素微藻的遗传转化。在此试验中,他利用硅藻的遗传转化系统,超量表达ACCase基因(acc1),初步结果显示,转基因硅藻中ACCase的活性增加了2~3倍。
　　2.2脂肪酸合成酶(FAS)
　　脂肪酸合成过程中,乙酰辅酶A经乙酰辅酶A羧化酶催化转变为丙二酰辅酶A后,脂肪酸合成酶(FAS)就以丙二酰辅酶A为底物,继续进行脂肪酸的合成[19]。在植物中,FAS由ACP(酰基载体蛋白)和其他6种酶构成。其中,Dehesh等克隆了编码菠菜酮酰-ACP合酶(KASⅢ)的cDNA基因,使其在烟草、拟南芥和橄榄型油菜中超量表达。结果与正常植株相比,饱和脂肪酸(16∶0)都有所增加,不饱和脂肪酸含量下降[20]。
　　2.3酰基辅酶A:甘油二酯酰基转移酶(DGAT)
　　酰基辅酶A:甘油二酯酰基转移酶(acyl CoA:diacylgy-cerol acyltransferase,DGAT)是一种完整的内质网细胞微粒体酶,是催化三酰甘油(triacylgycerol,TAG)合成的最后一步反应的酶,也是甘油三酯合成过程中唯一的关键酶和限速酶。该酶的主要作用机制是使二酰甘油(diacylgycerol,DAG)加上脂肪酸酰基辅酶A形成三酰甘油[21-24]。Jako等首次在野生型拟南芥中,超量表达了种子特异性DGAT的cDNA,结果DGAT的活性增加了10%~70%,种子含油量也有显著增加[25]。Zhang等构建了特异hpRNA(具发夹结构的双链RNA),用它沉默烟草内源性DGAT1基因,转基因植株的成熟种子含油量下降了9%~49%[26]。
　　2.4乙酰辅酶A合成酶(ACS)
　　乙酰辅酶A合成酶不可逆的催化醋酸形成乙酰辅酶A,而乙酰辅酶A可以为脂类的合成提供原料。Roughan等发现乙酰辅酶A合成酶可以将醋酸转化为乙酰辅酶A,并进入脂类合成途径[27]。Lin等在大肠杆菌体内超量表达了其自身乙酰辅酶A合成酶基因(acs),与对照组相比,乙酰辅酶A合成酶的活性增加了9倍,同时也加速了脂类的生物合成[28]。
　　2.5ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)
　　ATP-柠檬酸裂解酶催化柠檬酸形成乙酰辅酶A和草酰乙酸,乙酰辅酶A可以为脂类的合成提供原料。Ratledge等研究了ACL的活性与甘蓝型油菜种子脂质积累的关系,发现在种子快速合成脂质过程中,ACL和乙酰辅酶A羧化酶一样,其活性达到最大[29]。Rangasamy等研究了老鼠肝脏ACL基因在烟草质体中的异源超量表达,结果表明超量表达老鼠ACL基因,使烟草质体中总ACL活性增加了4倍,脂肪酸的合成也增加了16%[30]。
　　2.6苹果酸酶(ME)
　　苹果酸酶以NADP+为辅酶,催化苹果酸脱氢产生丙酮酸和NADPH,NADPH可用为脂肪酸合成中的还原反应。于是有人提出通过超量表达苹果酸酶,为脂肪酸合成提供充足的还原动力,从而达到提高脂肪酸含量的目的。Wynn等[31]发现苹果酸酶为构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的脂质积累提供主要的还原动力NADPH。随后,Wynn等又进一步研究了NADPH与脂质积累之间的关系。即在丝状真菌中超量表达苹果酸酶,结果有大量NADPH生成,为脂类的合成提供了充足的还原动力,同时也增加了脂质的积累[32]。Zhang等在卷枝毛霉(Mucor circinelloides)中超量表达了苹果酸酶,结果发现苹果酸酶的活性增加了2~3倍,同时脂质的生物合成也增加了2.5倍[33]。
　　2.7β-氧化途径
　　脂肪酸的β-氧化途径,是生物体内脂肪酸降解的主要途径,它发生于原核生物的细胞溶胶及真核生物的线粒体基质中。因此,有研究者提出限制脂肪酸β-氧化途径的发生来提高含油植物的脂类含量。其中,Hara等用念珠菌研究了β-氧化途径中的关键酶——酰基辅酶A氧化酶,阻断对该酶所有基因的编码,并希望能增加二羧酸的生成。但结果相反,重组体念珠菌不能利用烷烃,也不能生产二羧酸[34]。由于直接对β-氧化途径关键酶的研究有一定的局限性,Cao等从酯酰辅酶A跨膜转运的角度,对提高念珠菌二羧酸生成进行了研究。在其研究中,通过对肉碱-酯酰转移酶(CAT)基因在重组体中的特异表达,发现当CAT的活性减少1/2时,二羧酸的产率增加了21.0%,对烷烃的转化能力增加了12.0%。但是,如果将CAT基因全部敲除,则重组体不能利用烷烃生产二羧酸[35]。
　　2.8磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPase)
　　许多研究者发现油菜蛋白质含量与油脂含量呈负相关,于是有人提出对应的反义技术调控植物油脂含量。陈锦清等[36]提出油脂和蛋白质的“底物竞争”假说,认为葡萄糖酵解产物——丙酮酸是油脂和蛋白质合成的共同底物,2种物质在合成中竞争丙酮酸。乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)和丙酮酸羧化酶(PEPCase)分别是这2种物质合成的关键酶,它们的相对活性就决定了丙酮酸的流向。在这项研究中,他将根癌农杆菌EHA101携带反义PEP基因,然后转化甘蓝型油菜——浙油758和浙优油1号的下胚轴,成功地获得了转基因植株。对浙油758转基因植株的含油量测定显示,种子平均含油量比对照组高6.4%。对浙优油1号转基因植株的油脂及蛋白质含量测定表明,种子平均含油量比对照组高16.7%,其中1株油菜蛋白质含量下降9.7%。对转基因植株及对照组种子的油脂和蛋白质含量进行回归分析表明,2种植株的油脂和蛋白质含量呈显著负相关。张银波等构建了PEP基因的RNAi载体,希望通过抑制蛋白质的合成以使丙酮酸转向油脂的合成。由于RNAi技术的有效性及简易性,若该载体成功实现抑制目的基因,则可以为高油作物的培育开辟新的途径[37]。微藻PEPase的研究借鉴对含油植物的研究方法,其中宋东辉等采用反义PEP技术调控微藻PEPase的代谢途径,初步结果显示,反义抑制PEPase酶活性可以显著提高微藻脂类含量[1]。
　　3结语
　　生物柴油具有可再生、污染小、燃烧性高等优点,是一种新型环保可再生能源,具有极广阔的应用前景。目前,世界生物柴油的生产原料主要为含油植物,但根据我国食用油尚需大量进口的情况,不可能将植物油大规模用于生产生物柴油。而且我国土地资源有限,大幅度增加含油植物种植面积难度很大。因此,若要大规模发展我国生物柴油产业,必须寻找其他的生物柴油原料。利用微藻生产生物柴油可以很好地解决上述问题。微藻生长周期短,生长速率快,光合作用效率高,而且不占用农业用地,可以利用微生物发酵技术,在光反应器中高密度培养。因此,将微藻作为生产原料是我国生物柴油产业发展的必然趋势。