皮肤屏障研究方法的新进展
摘要：皮肤屏障为化学物经皮吸收的限速层，对维持机体内环境的稳定及抵御外环境的有害因素，有着重要的生理功能。深入研究皮肤屏障生理功能的首要任务就是建立有效的研究方法。本文从皮肤屏障的功能和结构两方面，对近年来应用于该领域研究方法的新进展作一概述。
皮肤位于体表，具有重要的屏障作用。随着工农业产生和国防科技的日益，人们接触的化学物质越来越多，相当数量的化学物在一定条件下可损伤皮肤或经皮肤吸收进入体内，导致机体全身中毒。皮肤屏障对防止化学物致机体中毒功不可没。此外，在化妆品和护肤品的使用方面，无论是隔绝外来有害因素还是吸收有益物质，均与皮肤所具有的屏障功能密不可分；尤其在对化妆品和护肤品功效进行评定时，皮肤屏障状况（改善程度、修复力度等）的研究和评定更为重要。皮肤屏障的研究工作应广为开展，而实现这一目标，首要工作是皮肤屏障的主要结构，是化学物经皮吸收的限速层。本文从皮肤屏障的功能及结构两方面，就其研究方法的新进展作一综述。
功能方面
皮肤屏障具有两方面的功能：防止外界化学性、特理性或生物性有害因素的入侵；防止体内水分和营养物质的丧失以及不需要物质的吸收。为此，测定有关物质的丧失或入侵以及其在皮肤中的分布，可对皮肤屏障进行研究和评定。在化妆品和护肤品的安全性和有效性的评定中，大多采用这方面的方法。
水分作为角质层的重要成分，是有关酶对皮肤脂质和其它成分进行水解所需，具有维持皮肤角质层柔韧性的作用。皮肤屏障的一个主要功能就是防止机体水分经皮肤散发到周围环境中，但水分仍可经汗管或经被动转动到达皮肤表面，蒸发测定仪（ evaporimeter）具有湿度和温度传感器，可对皮肤表面水分蒸发的浓度梯度进行测量，其结果以经皮水分丧失量（ tEWL）表示。 tEWL值的大小取决于皮肤角质层的完整性，可灵敏地反映出角质层的完整性及皮肤的水屏障功能，当皮肤受到外界物理化学因素的刺激和损害时。 tEWL值升高[1]。。 tEWL参数作为无损害性的皮肤屏障功能测试指标，具有重现性，有利于评价各种化学物对皮肤屏障的影响，是一种常用测试指标，测定中需考虑到室内温度和周围环境湿度等影响因素。目前，欧洲接触性皮炎协会的标准化组织已建立了进行 tEWL测定的准则[2]。
corneometer为一种常用测定皮肤电容值的仪器，其工作原理是电容器作为仪器探头，可受探头所接触物质的介电常数影响。由于水分是皮肤上介电常数量最大的物质，当水分含量发生变化时，皮肤的电容值亦发生变化，故可通过测定皮肤电容值，对皮肤所含水分进行分析，以评价皮夫屏障的状况。 serup[3]采用该仪器进行实验测试，发现该法局限性较大，易受周边因素（如皮肤表面温度的波动、其它物质的使用等）的影响。但该法简便易行，常配合 tEWL测定，对皮肤屏障进行评价。
刺激性化学物可引起皮肤炎性反应，致使皮肤血流量增加，影响皮肤屏障，故皮肤微循环状况亦可反映皮肤屏障状况的改变。烟酸已酯（ hexyl nicotinate）为一种血管扩张剂，皮肤表面使用可增加皮肤血流量，测定烟酸已酯使用后皮肤血流量的变化，可对皮肤屏障进行评价。早期常使用激光多普勒对皮肤微循环血汉量进行测定。其基本原理在于激光多普勒可通过分析红细胞所散发的光线而对血流情况进行检测。 agner[4]使用该法分析皮肤屏障的状况，以对刺激物所引起的皮肤炎性反应进行评估，结查表明该法对于区分阳性或阴性皮肤炎性反应有利，但对于强阳性皮肤炎性反应则检测效果不佳。该法亦为一种无损害性的皮肤屏障评估方法，重复性较好，但参数有较宽的正常值范围。有关皮肤血流量的测定标准业已颁布[5]。此外，皮肤炎性反应可使皮下血流量发生变化，以致皮肤表面出现红斑，为此有学者据此提出一种对皮肤表面红斑大小进行分析，以评价皮肤屏障功能的方法[6]。 clarys[7]使用色度检测仪对皮肤表面红斑大小进行测定，同时将结果与皮肤 tEWL值和皮肤电容值进行比较，结果表明该法可行。但使用上述两种方法评价皮肤屏障功能，均具有较大的局限性，需参阅其它参数。
化学物可经皮渗透进入体内，当皮肤屏障受到破坏时，化学物的经皮渗透量或渗透率增加。使用 valia-Chien双层渗透小室进行化学 物经皮渗透的性能测试，所渗透化学物经高效液相色谱法测定，结果以化学物经皮渗透量或渗透率表示。实验结果表明，测定化学物的经皮渗透性能够反映皮肤屏障的状况。此法灵敏可靠，但费时。此外，也有采用放射性核素标记所渗透物质，然后通过液体闪烁计数仪测定放射性核素的活度变化，对皮肤层屏障进行评价[8]。该法准确灵敏，但需防止放射性对人体的危害，且废物处理麻烦。
seidenari[9]采用机化20MHz的 b超仪分析 naOH溶液所致皮肤刺激反应，以对皮肤屏障进行评估。同时将实验结果与 tEWL测定的结果比较。低回声皮肤区域增加，伴有 tEWL上升；高回声区域的 tEWL显著升高，皮肤屏障受到破坏。此法为非损伤性测试方法，但不常用，其具体机制尚不清楚。
结构方面
表皮角质层为皮肤屏障的主要结构，类似“砖墙结构”。其中角质细胞类似砖墙结构中的“砖块”，细胞间基质中脂质类似填充于砖块并粘着砖块的“灰浆”。通过对“砖块和灰浆”的检测，可进行皮肤屏障的评价。
表皮角质层由近20层角质细胞相互连接而成。在角质形成细胞的生命周期中，角质形成细胞不断增生分化，逐渐变平上移，期间细胞核及细胞器消失，最后完全角化成充满角蛋白和无定形基质的角质细胞，形成具保护作用的角质层。正常表皮的更新时间（ turnover time），包括角质层的更新时间约为52～75天，可直接反映表皮细胞的增生分化活性。为此， effendy[10]采用荧光标记法，测定荧光强度在皮肤内的减弱程度，确定角质层更新时间，以评价外用药物对皮肤屏障的影响。此时角层更新时间为标记开始到荧光消失的时间。
有学者对皮肤角质层直接进行检测，以评估皮肤屏障的状况。 norlen[11]从20名女性胸部皮肤分离出角质层，将期浸泡在不同温度的蒸馏水中，使用共聚焦激光扫描显微镜观察角质层的膨胀程度，发现经氯信/甲醇（2：1）提取细胞间脂质后的角质层膨胀程度减弱。因角质层膨胀的机制可能与细胞间脂质结构密切相关，而后者对皮肤屏障形成有着重要作用，故角质层的膨胀行为在一定程度上也可反映皮肤屏障的状况。此外，使用胶带粘贴皮肤，测定胶带所粘物质的重量也不失为一种直接检测角质层的方法。胶带所粘物质的重量通常使用称重法来确定，与胶带粘贴次数无线性关系。但由于实验费时费力，为此， marttin[12]基于胶带所粘蛋白质的吸收光与角质层的重量成正比，建立了分光光度分析胶带所粘物质重量的方法。该法较称重法简易、快速，但由于胶带上有些物质的散发光掩盖了大部分蛋白质吸收光而使该法可靠性减弱。 dreher[13]采用改良 lowry测试方法，定量测定角质层中的蛋白质，以对皮肤屏障进行评估。此法较称重法更为灵敏精确，且重现性好。
皮肤经固定、包埋、切片、染色等过程，在光镜和电镜下可直接观察组织细胞的变化和超微结构的改变等。 ruO4固定皮肤标本后，经透射电镜对板层体脂质结构进行观察；油红 o（ oil red O）染色则可用于角质层中性脂质含量变化的判断；此外，碱性溶液浸泡皮肤标本后，甲基蓝染色便于角质层层数的测定。 shen[14]采用上述方法进行角质层板层脂质结构是否发生异常的检测，结果发现受检者皮肤角质层中板层脂质结构异常，且颗粒层被膜颗粒的数目明显减少。 ghadially[15]指出皮肤通透性屏障的自我稳定需要有板层体内容物的形成和分泌，以及板层体在细胞外结合成板层脂质结构的过程。可见，角质层板层脂质结构的分析有利于皮肤屏障的研究，上述方法可行。
表皮脂质组成的变化在表皮细胞分化过程中极为显著。在细胞分的最后阶段，颗粒细胞分泌出板层体内容物到细胞间隙中，形成板层脂质结构。 abrams[16]发现有机溶剂接触可提取皮肤脂质，使皮肤屏障功能显著降低。皮肤屏障的修复伴随着角质层脂质的更新，因此表皮角质层脂质的分析有利于皮肤屏障的评价。 denda[17]使用红外线光谱分析仪（ aTRIR）对角质层脂质进行分析，以评价皮肤屏障的状况，其结果与 tEWL测定的结果相关性较好，表明正常皮肤的角质层脂质对于皮肤屏障的形成极为重要。 ribaud[1 8]通过小角度 x线衍射对表皮角质怪的板层脂质结构进行分析，结果提示角质层脂质的化学性质及其结构排列对皮肤屏障功能的发挥有着重要作用。
角质层板层脂质结构不同于其它生物膜结构，它所含有的脂质主要由神经酰胺、胆固醇和脂肪酸组成。为此，有学者从分析角质层脂质的组成出发，对皮肤屏障的状况进行评价。 motta[19]分离出皮肤角质层，通过 bligh-Dyer法提取角质层脂质，铺放在高效薄层层析板上，通过计算机化密度计对角质层脂质进行定量和定性分析，并将结果与 tEWL测定进行比较，以对皮肤屏障进行评价。结果显示，神经酰胺作为角质层脂质中最为主要的脂质，对于皮肤屏障的功能调节极为重要。 di nardo[20]使用该法进行皮肤屏障研究，也获得相同结论。使用此法进行皮肤屏障研究较为灵敏，但操作步骤复杂。
结语
社会人们接触的化学物越来越多，特别是化妆品和护肤品的使用日益广泛，使人们对化学物经皮肤影响整个机体的认识加深，同时也使皮肤屏障的作用显得更为突出。皮肤屏障的研究对于提高皮肤提高皮肤防护能力、避免化毒物入侵、防治职业性皮肤病、提高皮肤外用药疗效，尤其在提高化妆品和护肤品的功效上，有着重要理论意义和应用价值。
1Barel aO et al. Skin Pharmacol, 1995;8:186-195
2 pinnagoda J et al .Contact Dermatitis,1990;22:164-178
3 serup J. Acta Derm Venereol(Stockh),1992;Suppl177:34-38
4 agner T et al .J Invest Dermatol,1990:95:543-547
5 bircher A et al. Contact Dernatitis.1994;30:65-72
6 di Nardo A et al. Contact Dermatitis,1996;35:86-91
7 clarys P et al.Contact Dermatitis,1997;36:240-243
8 pirot F et al. Proc Natl Acad Sci USA.1997;94:1562-1567
9 seidenari S et al. Acta Derm Venereol,1995;75:97-101
10 effendy I et al.Br J Dermatol,1996;135:545-549
11 norlen L et al .Arch Dermatol Res .1997;289:506-513
12 mattin E et al.Skin Pharmacol,1996;9:69-77
13 d reher F et al.Acta Derm Venereol(Stockh),1998;78:186-189
14 shen HM e et al. Br J Dermatol,1997;136:884-890
15 ghadially R et al .J Invest Dermatol,1996;107:558-564
16 abrams K et al. J Invest Dermatol,1993:101:609-613
17 denda M et al .Arch Dermatol Res ,1994;286:41-46
18 ribaud C et al .Pharm Res ,1994;11:1414-1418
19 motta S et al. Arch Dermatol,1994;130:452-456
20 di Nardo A et al .Contact Dermatitis,1996:35:86-91
