儿童实体瘤中mdrl基因与P53基因的表达及关系

　　摘要: 在儿童肿瘤的中，化学治疗是主要手段之一，但肿瘤细胞的耐药性是影响其疗效的主要障碍。mdrl基因/Pgp的过度表达与某些儿童实体瘤的耐药、较差的预后、化疗和病理分型相关，肿瘤细胞mdrl基因表达水平的检测，有较大的临床意义。P53突变率。体外培养和基因转染研究表明P53基因对mdrl启动子的调节作用，野生型P53能够抑制mdrl基因转录，减小Pgp生成，而突变型P53能刺激mdrl启动子，增强mdrl基因的表达。而在小儿实体瘤中，P53基因可能对mdrl基因也有调控作用。

　　1．Mdrl基因与儿童实体肿瘤的多药耐药性

　　在儿童肿瘤的治疗中，化学治疗是主要手段之一，但肿瘤细胞的耐药性是影响其疗效的主要障碍。肿瘤耐药性的特点是，耐药性瘤细胞可以对一些在结构和功能上迥然不同的药物产生耐受，即所谓多药耐药（Multidrug Resistance,MDR）现象。肿瘤细胞耐药可分为内在性耐药和获得性耐药两类。目前，有近一半的儿童恶性实体瘤不能治愈，MDR是导致肿瘤化疗失败的重要原因。据美国癌症患者中，90%以上在不同程度上受到耐药的影响。近10年来，许多学者致力于肿瘤的多药耐药性研究，试图揭示MDR的本质和其作用机理，同时对MDR的逆转进行研究。

　　1．1 mDR表型与P-糖蛋白

　　1968年，Kessel等首先在啮齿类动物的细胞中发现MDR现象。1976年，Juliano 和Ling的研究对秋水仙碱耐药的仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster Ovary ,CHO）时，发现其胞膜中有一个分子量约170kDa的糖蛋白与细胞膜的通透性有关，于是命名为P-糖蛋白（P-glycoprotein,Pgp）。该蛋白的发现，首次解释了产生MDR的分子机制。

　　近来有关MDR细胞株研究结果揭示MDR细胞株常表现出复杂的多元化。表型归纳起来主要表现在：①增强对多种细胞毒药物耐受；②降低细胞内药物浓度；③过度表达170-180kDa膜糖蛋白（Pgp）；④增加药物的细胞外排能力；⑤协同细胞膜活性因子感受性；⑥耐药能力能被某些化学物质逆转。

　　与MDR有关的许多药物都是临床上常用的化疗剂，如阿霉素、长春新碱、长春花碱、VP-16、放线菌素D、丝裂霉素等。虽然MDR可由多种原因引起，如谷胱甘肽及相关酶的改变、拓扑异构酶Ⅱ的改变、DNA损伤修复能力增强、多药耐药相关蛋白表达增加、蛋白激酶C的变化。但多方面研究证实，多药耐药基因（Multidrug resistance Gene, mdrl）及其产物Pgp的过度表达是其主要原因之一[1]。

　　1．2 mdrl基因的结构和功能

　　多药耐药基因mdrl定位于7号染色体的7q21.1。对mdrl基因的全长cDNA序列分析表明，其编码蛋白有1280个氨基酸残基，分子量约140kDa;经翻译后修饰再加上约30kDa的糖链，即为分子量170kDa左右的Pgp。氨基酸序列对比发现，Pgp属于ATP结合盒超家族成员，P-糖蛋白属于一种依赖ATP供能的转运蛋白，主要分布在细胞膜上。其功能涉及到转运细胞中，其生存环境间的多种物质，如肽类、内源性激素、异生物（包括各种天然及半合成化疗药物），在某些生理情况下，还可以作为氯离子通道，转运氯离子。

　　1．3 mdrl/Pgp 在儿童肿瘤中的表达及作用

　　Oda Y[2]用RT-PCR、Northern吸印转移法和免疫组化技术检测了36例儿童实体瘤，结果13例神经母细胞瘤中11例（47.8%），11例肾母细胞瘤中7例（63.3%），显示mdrl的PCR产物，Northern吸印转移法分析显示，34例标本中11例（32.4%）检出mdrl基因，免疫组化结果显示36例标本中26例（72.2%）表达Pgp，统计分析示免疫组化检测与RT-PCR检测结果呈显著性相关（P=0.0001）。Re GG[3]通过免疫组化和mRNA分析，21例肾母细胞瘤，结果普通型肾母细胞瘤mdrl和Pgp表达全部阴性，3例间变肾母细胞瘤有1例显示m drl和Pgp表达，同时体外细胞培养证实存在Pgp表达和耐药性，研究者认为Pgp表达与肾母细胞瘤的病理分型相关。VolmM[4]用mRNA分析、PCR和免疫组化方法，检测8例术前没有接受化疗肾母细胞瘤中的Pgp的表达，结果全阴性，而术前接受化疗的23例肾母细胞瘤中，12（52.2%）例阳性，Pgp总的阳性率为38.7%（12/31）。研究者认为Pgp的表达与化疗有关。

　　Serra-M[5]用免疫组化法检测105例原发和转移骨肉瘤，Pgp表达率分别为23%和50%，认为Pgp过度表达与高的复发率和较差的预后显著相关，支持Pgp在抗药反应中的作用，还有报道一些小儿实体肿瘤如儿童肉瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤，均显示Pgp表达与差的预后相关。

　　研究结果表明，肿瘤细胞mdrl基因表达水平的检测，有较大的临床意义：①初治时mdrl基因表达的水平，能大致反映肿瘤对化疗是否敏感，初步预测化疗的效果；②在有些肿瘤，如骨肉瘤、神经母细胞瘤、小儿软组织肉瘤、小儿髓母细胞瘤等，mdrl基因表达水平与患儿预后呈负相关，mdrl基因的表达可作为一项预后指标；③对复发肿瘤患儿，mdrl基因表达水平升高是获得性MDR的标志，临床治疗中可能需更改化疗方案；④mdrl的检测还可能作为选用化疗增敏剂的指标，在指导肿瘤治疗中发挥重要作用。

　　目前，比较清楚是蛋白激酶C可以在mdrl的蛋白水平发挥调节作用，前者通过对后者磷酸化或磷酸化，而影响后者功能的发挥。外源性异物、某些金属盐类等，均能诱导Pgp的暂时高表达；某些癌基因也可能调节mdrl基因的表达。

　　1．4 pgp介导的多药耐药性的逆转研究

　　Pgp发挥能量依赖型外排泵的作用对象无特异性。对化疗药物以外的许多非细胞毒性化合物，Pgp也能将其从细胞内主动地转运到细胞外。因此，当胞膜上的Pgp含量恒定时，化疗药物与此类非细胞毒性化合物 pgp结合就存在着竞争。提示如果增加其它化合物与Pgp的结合就会减少其对化疗药物的外排，提高化疗药物的细胞内浓度，增强药物对肿瘤细胞的作用，这称为MDR的调节或逆转。此类化合物通称MDR调节剂、MDR逆转剂或化疗增敏剂，包括：钙离子通道阻滞剂（维拉帕米及其衍生物）、环孢菌素（环孢菌素A及其衍生物）、钙调蛋白抑制剂（三氟丙嗪等吩噻嗪类化合物）、抗疟药（如奎宁）等。目前，应用此类药物逆转肿瘤细胞的MDR表型。目前，应用此类药物逆转肿瘤细胞的MDR表型，增加化疗药物对肿瘤细胞的作用已开始进入临床试验。

　　Miniero等[6]对一组20例儿童晚期肿瘤，进行了联合治疗，MDR逆转剂用维拉帕米和环孢菌素A，化疗用阿霉素和VP-16，结果5例患儿获得完全缓解。Maia RC等[7]报告15例用VP-16治疗复发的白血病患儿，经VP-16和环孢菌素A联合治疗，其中2例Pgp免疫组化染色阳性患儿对治疗有反应。

　　儿童恶性肿瘤的MDR表型及其逆转，值得进一步深入研究。尽管目前MDR逆转剂与化疗联合应用，治疗儿童恶性肿瘤尚处于临床试验阶段，但随着对MDR机制的深入了解，体外细胞MDR表型逆转试验的成功，和高效MDR逆转剂不断发现，并逐步用于临床，儿童恶性肿瘤支化疗药物的MDR将被克服，将儿童恶性肿瘤的治愈带来新的希望。

　　2． p53基因与儿童肿瘤

　　2．1 p53 基因的结构

　　P53基因是一种肿瘤抑制基因，位于17号染色体短臂17p13.1，其DNA全长16kb～20kb，由11个外显子和10个内含子组成，外显子2、4、5、7、8编码5个进化高度保守的mRNA结构区，其蛋白质产物定位于细胞核，为一种含有393个氨基酸磷酸核蛋白，分子量约为53kDa。

　　2．2 p53基因的生物学功能

　　P53基因作为转录因子，通过两个途径调节细胞生长和发育，一为调节DNA复制启动复合物的组装和功能，对细胞进入S期进行调控；二为P53基因可能是某些抑制细胞增殖的基因的反式激活因子，从而对细胞分裂进行负调控。P53基因诱导调控其下游调节因子的转录，如WAF1/CIP1、MDM2、G ADD45等与细胞生长或抑制有关的基因，它们在上游区具有与P53结合位点共同的序列，受P53负调控，影响细胞生长或分化。

　　野生型P53基因作为分子警察（Molecular policeman），监视细胞基因组的完整性。如果DNA遭受紫外线辐射或癌症化疗药物损伤后，P53蛋白累积，DNA得制停止，介导细胞停滞在G1期，并启动修复系统，予足够的时间进行DNA修复。如果修复失败，则P53丧失了这种功能，基因组稳定性下降，突变和染色体重排以较高速率发生，导致恶性克隆的出现。P53基因不仅能通过增加肿瘤细胞凋亡来限制肿瘤的，还与肿瘤细胞对化疗药物的敏感性有关。P53基因是化疗药物活化调亡路径上的中介，即化疗药物有效活化凋亡路径需要P53的参与。因此，含有野生型P53基因的肿瘤细胞对化疗敏感，含有突变型P53基因的肿瘤细胞，P53依赖的凋亡路径失活，对化疗药物产生耐药性，只有大剂量的化疗药物方可重新活化P53依赖的凋亡路径。

　　2．3 p53基因在儿童肿瘤中的表达及作用

　　在P53基因的11个外显子和10个内含子中，突变好发部位为外显子5-8，被称为突变热点，约相当于编码子132-281区域。目前研究表明很多肿瘤既有P53双等位基因的突变，又有单基因位点的突变并伴有野生型位点的丢失。故在不同的肿瘤中P53基因改变呈多种形式，即：①错义突变；②选择突变，多数集中在130-290号氨基酸上，尤其是4个高度保守区（130-142，171-180，234-260，270-287）；③至少存在3个突变热点（175，248，273号氨基酸），不同组织类型突变热点的频度和分布并不相同。研究表明P53基因的突变是人类肿瘤中最常见的改变，大约50%人类肿瘤都有P53基因的突变。检测病人P53的突变可用于肿瘤的辅助诊断和预后的监测。

　　正常的P53蛋白在细胞中易水解，半衰期为20min左右，因而应用免疫组化方法不能检测到P53蛋白；而突变型P53­蛋白半衰期为2～12h，同时，突变的P53基因产生的蛋白构型发生改变，蛋白稳定性增加，导致半衰期的延长，并在恶性肿瘤细胞核内堆积，因而可应用免疫组化方法检测出P53蛋白的异常表达，反映P53蛋白在核内的积累，如SV40大T抗原和EB1b均能和P53蛋白结合形成一寡聚体蛋白复合物，导致P53蛋白的稳定性增加。研究表明P53蛋白的异常表达与P53基因突变具有很好的相关性。

　　BardeesyN[8]PCR-SSCP法检测了140例肾母细胞瘤中P53基因的突变，结果突变率为5.7%（8/140），其中11例间突变肾母细胞瘤中8例（72.7%）P53基因突变，认为P53基因是一个影响肾母细胞瘤生物学行为的重要抑癌基因，其突变涉及间变的发生，并可作为肾母细胞瘤间变的分子标记。Bahtimi r等[9]通过免疫组化技术、Northern吸印转移法，检测13例肾母细胞瘤的P53基因，结果3例（23.1%）阳性，10例普通型肾母细胞瘤均无P53基因突变，而3例间突变型肾母细胞瘤均有P53基因突变，认为在肾母细胞瘤间变过程中P53基因突变起重要作用。Govender D等[10]用免疫组化法检测93例肾母细胞瘤中P53蛋白的表达，共有8例（8.6%）阳性，其中86例预后好的组织型3例阳性，7例预后差的组织型5例（71.4%）阳性，证实P53蛋白表达与组织类型和差的预后相关。Lahoti c等[11]用免疫组化疗检测28例肾母细胞的P53，阳性率为64.3%（18/28），复发/转移组和非复发/非转移组分别为93.8%(15/16)和25.0（3/12），表明P53阳性表达与肾母细胞瘤的复发/转移正相关。

　　Kusafuka T等[12]用PCR-SSCP法和直接基因测序检测P53基因中5-8外显子的突变，82例儿童恶性实体瘤中，只有2例被检出P53基因突变，1例为横纹肌肉瘤，另一例为肝未分化肉瘤，认为儿童实瘤中P53突变是不常见的。但是Karami-topoulou e等[13]用免疫组化检测137例原发性中枢神经系统肿瘤和17例髓母细胞瘤，结果前者P53蛋白表达率为33.5%，且P53表达与肿瘤组织分级相关，在17例髓母细胞瘤8例（47.1%）P53蛋白表达。近来研究表明，儿童恶性星形细胞瘤和儿童恶性胶质瘤P53免疫组化检测阳性率高达37.9%～100%，且与差的预 后相关[14～16]。

　　以上研究表明P53基因突变与某些小儿实体瘤的恶性程度、复发、转移和差的预后相关，可作为肿瘤的恶性指标之一。小儿神经系统肿瘤有较高的P53突变率。

　　3．Mdrl基因与P53基因的关系

　　Chin kV等[17]，Goldsmith ME等[18]通过体外培养和基因转染，研究P53基因对mdrl启动子的调节作用，认为P53能调控Pgp的表达，野生型P53能够抑制mdrl基因转录，减少Pgp生成，而突变型P53能刺激mdrl启动子，增强mdrl基因的表达。Linn SC等[19]用双标免疫组化染色检测50例乳腺癌病例中的P53和Pgp表达，显示Pgp表达和核P53积累常常同时发生在同一种瘤细胞内，在全部50例乳腺癌病例中，P53和Pgp表达显著相关，认为Pgp和突变型P53共同表达，属于一系列分子事件，导致更加侵袭的表型、药物耐药性和差的预后。Oka M[20]等用免疫组化方法检测40例结肠癌组织，结果Pgp表达与P53蛋白积累正相关，支持在体外培养突变型P53激活mdrl基因的论点。而在小儿实体瘤中，P53基因可能对dmrl基因也有调控作用，有待进一步研究。

　　总之，P53基因和Pgp与肿瘤的发生、发展、肿瘤耐药性有密切关系，检测Pgp和P53基因突变对肿瘤的早期诊断、预后判断等方面均展示了广阔的前景，可为化疗方案制定了体化提供理论依据，同时对肿瘤细胞mdrl基因和P53基因的进一步研究，将有助于阐明肿瘤发生发展和肿瘤耐药的分子基础，为肿瘤的基因治疗提供坚实的基础。

主要

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