肝干细胞与干细胞移植治疗急慢性肝病的研究进展

关键词：肝干细胞 

　　肝干细胞发现于20世纪50年代末，1956年，Farber［1］将肝内可能具有分化潜力的细胞描述为卵圆细胞，1958年Wilson和Leduc［2］提出肝干细胞的概念。近年来，人们发现肝干细胞移植对急慢性肝脏疾病有明确的作用，使之成为消化领域的研究热点。本文对肝干细胞及干细胞移植治疗肝病的研究进展做一综述。
　　1  肝干细胞的来源与分类
　　根据肝脏干细胞起源的不同，可将其分为肝源性肝脏干细胞和非肝源性肝脏干细胞，前者包括卵圆细胞、分化的肝细胞、胚胎肝细胞和胆管上皮细胞，后者则为源于胚胎干细胞、骨髓造血干细胞及胰腺上皮干细胞等不同来源的肝脏干细胞。在特定条件下，造血干细胞和骨髓间充质细胞均可转化成肝细胞。
　　1.1  胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）  ES细胞来源于早期胚胎,具有多项分化潜能,可以在体内或体外分化为多种组织细胞。Hamazaki等［3］在体外成功地将小鼠ES细胞定向分化为成熟的肝细胞,该细胞能表达AFP、甲状腺转运蛋白、A2抗胰蛋白酶、白蛋白等肝细胞特征。Hu等［4］则在直接观察到体外ES细胞向肝细胞转化的过程中，发现在培养液中体外ES细胞能转化为可分泌AFP、ALB的肝细胞。
　　1.2  骨髓干细胞  骨髓中含有的造血干细胞和间充质细胞具有较强的增生、分化能力。Lagasse等［5］将骨髓组织细胞移植给致死量放射线照射鼠，发现在受鼠肝脏中发现骨髓造血干细胞来源的成熟肝细胞，提示造血干细胞可以转化为肝细胞。Theise等［6］将正常雄性小鼠骨髓移植到正常雌性小鼠体内，应用荧光原位杂交方法检查雌性小鼠肝脏细胞Y染色体，发现雌性小鼠肝脏的部分肝细胞表达Y染色体，提示骨髓干细胞在正常肝脏环境中能分化为肝细胞。Petersen等［7］将雄性大鼠骨髓干细胞移植到致死量放射性肝损伤且肝细胞增生被抑制的雌性大鼠模型体内，发现该模型大鼠的部分肝脏细胞表达Y染色体，提示骨髓干细胞不仅在正常肝脏环境能分化为肝细胞，而且在肝脏某些病理的环境中也能分化为肝细胞。
　　1.3  胰腺上皮干细胞  胰腺中存在着肝脏前体细胞。Wang等［8］用野生型E.colilacZ转基因小鼠胰腺细胞移植入同系酪氨酸代谢酶基因（FAH）突变的小鼠脾脏,在小鼠脾脏中能检测到FAH（+）的肝细胞团。从胰腺分离的胰岛前体细胞在体外培养中可分化为肝上皮细胞，提示在胚胎发育过程中,一些原始的多能干细胞保持着未分化状态滞留在机体组织中。胰腺肝脏细胞同源性的这一特征，为进一步的临床治疗提供了又一肝干细胞来源。
　　1.4  肝干细胞
　　1.4.1  肝卵圆细胞（hepatic oval cell）  表现为核大而胞质小并具有特殊的细胞标记,细胞表面高度表达OV-6、白蛋白、CK等,形态呈卵圆形。卵圆细胞来自终末小胆管Hering管细胞,其数量与肝损伤的严重程度有关。在成年动物肝脏内肝卵圆细胞含量非常少,通常情况无法检测到。
　　1.4.2  肝小细胞  与肝卵圆细胞类似,多在严重肝损伤的情况下,可观察到肝小细胞增殖，该细胞直径为9~12μm的小型单个核细胞,呈铺路石样增殖,其性质介于肝细胞与肝管上皮细胞之间。在急性病毒性肝炎、暴发性肝衰竭恢复期、慢性肝炎及肝硬化患者的肝组织中可以观察到这种细胞。
　　2  各种干细胞分离方法
　　2.1  骨髓间充质干细胞的分离方法  骨髓干细胞主要有两大类，一类是造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs），它是血细胞的起源细胞，另一类是骨髓间充质细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）。骨髓中MSCs的含量很低，约为0.001%~0.01%，因此应用MSCs前，需对其进行分离及体外培养扩增。目前常用的分离方法为贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠分离法，其中流式细胞仪分选是目前分离骨髓干细胞的最常用方法之一。
　　2.2  肝干细胞的分离方法  目前分选、纯化肝干细胞的方法有密度梯度离心、流式细胞技术结合免疫荧光标记单克隆技术、免疫磁珠分选技术等,其中密度梯度离心无需特殊仪器及抗体，操作过程简单，可减少复杂操作对细胞活性的损伤，采用protease E选择性破坏肝实质细胞［9］，20μm滤膜滤过清除体积较大细胞，后经Percoll密度梯度离心获得高产量及活性率的肝干细胞。
　　3  急性肝损伤肝干细胞的激活与增殖
　　干细胞在肝损伤时具有分化增殖为肝细胞的能力，但给予正常及受损伤的动物干细胞治疗时，发现只在受损伤的动物观察到干细胞的分化与增殖，正常动物肝脏组织并无外源性干细胞生长迹象。说明细胞对于生长信号的反应因损伤的程度大小而异。正常肝脏中，肝干细胞处于休眠期，不分裂增生，当肝干细胞被激活后，必须在适宜的微环境中才能分化成熟。当部分肝细胞死亡和（或）暴露于有毒性物质时，卵圆细胞开始增生、分化为肝细胞，补充丢失或死亡的细胞。此外，造血干细胞只能在肝脏中分化为肝细胞和胆管上皮细胞。肝干细胞的扩增和分化是一个复杂过程，在该过程中，肝脏微环境和多种细胞因子、分化因子的表达起重要作用。Thorgeirsson等经过一系列研究认为参与肝干细胞增生和分化的因子包括干细胞因子及其受体c-kit系统、干扰素γ，肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）。另外，还包括与肝脏再生有关的生长因子:表皮生长因子（EGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、肝细胞生长因子（HGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）家族等。国内姚鹏等［10］报道HGF,表EGF、FGP能促进骨髓干细胞的增生、分化，TGF-β能诱导骨髓干细胞的凋亡，而TNP-α、IL-6对骨髓干细胞的生长无明显影响。目前很难确定促进和诱导肝干细胞分化及扩增的关键因素，这也是影响肝干细胞临床应用的一个难题。
　　4  干细胞移植治疗急慢性肝脏疾病
　　肝干细胞的移植方法较多，常用方法包括腹腔移植、脾移植、门静脉移植、肝动脉移植等。目前，动物实验进行较广泛，各种途径的移植应用于急慢性肝病的治疗，而临床上主要以肝动脉方式移植最为常用。
　　4.1  腹腔内移植  腹腔是干细胞移植最方便易行的治疗方法，但由于其有效的作用主要是通过肝脏受损伤时干细胞提供的细胞因子的作用，而并非腹腔内干细胞的增殖与分化的作用。且受腹腔内干细胞分化、增殖条件的限制，基本无临床应用前景。
　　4.2  脾内移植  Shi Z等［11］经脾脏进行胚胎干细胞移植治疗Wilson’s病模型鼠，移植后第2、4周，在肝内可见胚胎干细胞来源的干细胞增殖。说明脾脏内移植的胚胎干细胞有分化为成熟肝细胞的能力。苏娟等［12］采用人胎肝干细胞在小鼠腹腔及脾内移植，移植后观察结果证明了胎肝干细胞能在损伤肝脏中增殖并分化为肝细胞。移植在脾脏的干细胞虽然能在短期内达到改善肝功能的目的，但由于其不能在脾脏内形成有效的肝小叶等排泌结构，其依赖于脾脏内干细胞的分化，长期效果主要是来源于由脾脏回流到肝脏的干细胞的分化增殖。
　　4.3  门静脉或肝内移植  理论上肝脏本身是肝细胞移植的最佳器官，因为门脉内含高浓度的嗜肝细胞因子和局部生长因子。Lagasse等［5］将纯化正常小鼠的骨髓造血干细胞（HBSC）经静脉移植给有代谢性肝病（酪氨酸血症Ⅰ型）的小鼠，发现能逆转后者的肝功能、延长其寿命。Akushida T等［13］通过门静脉进行干细胞移植治疗Wilson’s病模型小鼠，移植后14天，肝内发现干细胞来源的肝细胞，而腹腔内移植则无此发现。Fan TX等［14］在此途径进行干细胞移植时也有类似发现，并发现干细胞可经肝脏种植于脾及骨髓中。经门静脉移植的多篇显示，干细胞可在不改变器官微结构的情况下与受体肝实质相融合。但临床应用中，移植后门静脉及肝小静脉血栓形成是影响其广泛应用的又一障碍。
　　4.4  肝动脉移植  姚鹏等［15］采取患者自体骨髓分离纯化骨髓干细胞，行肝动脉方式移植入肝脏中治疗慢性肝功能衰竭。结果自体骨髓干细胞移植治疗8周后，移植组患者临床症状、肝功能和凝血机制明显改善。张强等［16］报道同样方法经肝动脉自体骨髓干细胞移植治疗肝硬化患者，结果20例患者中14例有效，6例无效，收到良好短期疗效。由于临床工作只是起步阶段，但有效的临床结果令人鼓舞。
　　5  肝干细胞移植治疗肝病的展望
　　随着肝干细胞研究的深入，以下问题的解决，可能会推动干细胞移植的临床应用：（1）自体干细胞分离方法的简化和体外扩增速度的加快，是决定其用于治疗急性肝病的重要因素；（2）加强对干细胞诱导分化机制的研究，防止向肿瘤细胞分化；（3）移植途径的简单化，经皮经肝的门静脉移植可能是治疗肝病的最简单的有效方法，如何预防移植后血栓的形成是一个较重要的课题；（4）进一步研究与干细胞嗜肝特性相关因子，最终达到经外周血进行干细胞移植治疗肝病的目的；（5）开展干细胞基因修饰后移植治疗遗传性疾病及其他基因异常疾病的研究。

    总之，肝干细胞移植治疗急慢性肝病治疗的基础与临床研究均较活跃，随着基础研究的不断深入与广泛的临床应用，在不远的将来，干细胞移植治疗将给患者带来更大的福音。【】
　　1  Farber E.Simularities in the sequence of early histologic changes induced in the liver of the rat by ethionine.2-acetylaminofluorene.and 3-methyl-4 dimethylaminoazobenzene.Cancer Res,1956,16:142-149.
　　2  Wilson JW,Leduc EH.Role of cholangioles in restoration of the liver of the mouse after dietary injury.J Pathol Bacteriol,1958,76（2）:441-449.
　　3  Hamazaki T,Iiboshi Y,Oka M,et al.Hepatic maturation in differentiating embryonic stem cells in vitro.FEBS Lett,2001,497（1）:15-19.
　　4  Hu A,Cai I,Zheng Q,et al.Hepatic differentiation from embryonic stem cells in vitro.Chin Med J,2003,116（3）:1893-1897.
　　5  Lagasse E,Connors H,Al-Dhalimy M,et al.Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo.Nat Med,2000,6:1229-1234.
　　6  Theise ND,Saxena R,Portmann BC,et al.The canals of Hering and hepaticstem cells in humans.Hepatology,1999,30:1425-1433.
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　　8  Wang X,AL  Dhalimy M,Lagassel E,et al.Liver repopulation and correction of metabolic liver disease by transplanted adult mouse pancreatic cells.Am J Pathol,2001,158:571-579.
　　9  张金卷，杜智，李涛,等.人胎儿肝干细胞的分离及鉴定.天津医药,2005，33（5）：268-270.
　　10  姚鹏，胡大荣，詹轶群,等.细胞生长因子体外对大鼠肝干细胞的影响.中华肝脏病杂志,2003,11:33-36.
　　11  Shi Z,Liang XL,Lu BX,et al.Diminution of toxic copper accumulation in toxic milk mice modeling Wilson disease by embryonic hepatocyte intrasplenic transplantation.World J Gastroenterol,2005,11（24）:3691-3695.
　　12  苏娟，李文林,陶欣荣,等.人胎肝干细胞在重症联合免疫缺陷小鼠损伤肝脏中的植入.第二军医大学学报，2005，26（3）：243-246.
　　13  Taketoshi Rushida,Inaba M,Hishah,et al.Crucial role of donor-derived stromal cells in successful treatment for intractable autoimmune diseases in MRL/lpr mice by BMT via portal vein.Stem Cells,2001,19:226-235.
　　14  Fan TX,Ahisha H,Jin TN,et al.Successful allogeneic bone marrow transplantation （BMT） by injection of none marrow cells via portal vein:stromal cells as BMT- Facilitating Cells.Stem Cells,2001,19:144-150.
　　15  姚鹏，胡大荣，王帅,等.自体骨髓干细胞移植慢性肝衰竭研究.肝脏,2005，1（3）:171-173.
　　16  张强,李京雨,徐力扬,等.经肝动脉骨髓干细胞移植治疗肝硬化的初步临床应用.介入影像与治疗学，2005，2（4）：261-263.