建立Alzheimer氏病动物模型方法的研究进展

关键词： Alzheimer氏病动物模型 进展 

　　 摘要 AD型痴呆占老年性痴呆50%以上，严重危害着老年人的健康。国内外许多学者进行了大量有关AD的研究，特别是近年关于AD疾病的研究日益受到国内外学者高度重视。建立一个可靠的模型是研究该病的关键。迄今为止尚无一个公认理想的AD模型，本文综述了六十年代以来有关AD模型建立方法的研究进展状况，阐明了各种方法的优缺点。
　　随着人口老龄化的，老年性疾患已成为一个明显影响人类健康突出的问题，其中老年性痴呆（Senile dementia,SD）是最常见的老年性疾病之一，它和恶性肿瘤、心脑血管意外并列为导致老年人死亡的三大疾病。据国外报道，SD患病率占老年人群4-5%，其中半数以上为Alzheimer氏病（简称AD）。国内报道，我国老年性痴呆患病率为4.36%，其中AD患者占2.8%[1]。AD是一种原发变性型老年性痴呆，其特点是发病年龄较早，多在65岁以前，故又称作早老年性痴呆，病程进展缓慢，主要表现为近期记忆力明显减退，在神经化学方面，往往多种神经递质系统受损。
　　自1906年德国神经病家Alois Alzheimer发现AD以来，许多工作者进行了近一个世纪的潜心探究,从形态学、神经生物学和临床研究等方面做了大量工作，在AD的病理改变、发病机制及等方面都取得了可喜的成绩。关于AD病因有下述多种学说：⑴遗传学说[2]；⑵微量元素学说，其中提出最多的是铝和硅[3-4]；⑶神经递质学说，AD患者神经递质活动改变主要在海马、基底前脑核及大脑新皮质区。多数学者认为主要与乙酰胆碱能系统改变有关，其次为5-羟色氨能系统等[5-6]；⑷免疫反应学说，可能是独立因素，也可能是与感染、遗传和环境中毒相关的继发因素，并提出与白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）等有关[7-8]；⑸慢病毒学说[9]；⑹雌激素水平下降[10]。对上述病因学说，诸多学者互有争议，尚无一致认识。
　　临床上AD患者主要表现为大脑认知功能障碍，如健忘、记忆力和空间辨别能力减退以及反应迟钝等。关于AD的病理机制，目前较为明确的是：⑴基底前脑核群内乙酰胆碱（ACh）能神经元的变性和丢失；⑵患者脑内形成神经原纤维缠结；⑶新皮质和海马结构内出现大量的淀粉样沉积，其数量的多寡与AD的严重程度呈正相关[11]。近年已从淀粉样沉积核心中分离和鉴别出一种肽类物质，称为β-淀粉样肽（β-AP或β/A4蛋白）。β-AP是β-淀粉样前体蛋白（β-APP）的病理性裂解产物，正常情况下不表达，在正常老年人有极少量的表达。（4）脑内形成AMY斑块。这一病理改变是Trojanowski等人的最新发现，其与神经原纤维缠结、淀粉样沉积一起为AD病人的三大特征性病理改变[12]。由于AD疾病严重危害着老年人的健康，同时也给家庭和社会带来巨大的财政负担，因而，关于AD疾病的研究日益受到国内外学者高度重视。建立一个可靠的AD动物模型是研究AD的重要环节。有关AD动物模型建立的方法较多，各有利弊，本文将有关方法比较综术如下。
　　1 化学损伤
　　1.1 神经毒氨基酸损毁基底大细胞核（nucleus basalis magnocellularis,NBM）
　　1980年Ben-An、1985年Sofroniew等分别报道用兴奋性神经毒氨基酸，如红藻氨酸（KA）、鹅膏蕈氨酸（IBD）、使君子氨酸（QUIS）、N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）注入大鼠NBM，以损毁大鼠NBM建立痴呆模型[13-15]，随后国内外一些科研工作者采用上述方法建立了AD模型，并在此基础上进行了关于AD的一系列研究。1987年Dunnett等人用这四种神经毒氨基酸同时进行对比实验，结果表明使君子氨基酸特异性最高，对非胆碱能神经元损伤最小；KA对非胆碱能神经元损伤最大，且毒性作用是其它三种的2-3倍。使君子氨酸毒性作用相对缓和，剂量较易掌握，动物死亡率低，模型建立成功率高，因素基优于其它三种[16]。我们采用红藻氨酸进行实验证实了其毒性作用较强，很难掌握用量，动物易死亡，这与Dunnett等人的实验结果是一致的。总的来看这些神经毒氨基酸都可导致NBM的胆碱能神经元变性和减少，继而引进相应大脑新皮质区的胆碱能纤维减少，细胞变性与死亡，胆碱能的标志酶ChAT和AChE含量下降，学习记忆行为减退，所以可以用来建立AD的模型。但有以下几个缺陷：①无神经炎斑及神经纤维缠结的组织病理学改变[17]；②神经毒氨基酸对非胆碱能神经元也有影响；③ChAT的活性在海马末受影响；④据报道神经毒氨基酸对乙酰胆碱系统的损伤可逆转[18]；⑤业已证明AD病的基底核胆碱能神经元的丧失是逆行性引起的，即继发于大脑皮层的病理变化。1993年在第23届美国神经科学年会上Dunbar等也提出此种方法关非为AD的理想模型[19]。
　　1.2AF64A（Ethylcholine mustard aziridiniumion）
　　AF64A是一种特异的突触前胆碱毒。Mantione等人用AF64A注射入小鼠侧脑室进行其神经毒性的研究，发现AF64A可引起小鼠乙酰胆碱能系统的特异性损伤。如果用AF64A直接向大鼠背海马内注射，其对胆碱能神经系统的毒性较注入侧脑室强[20]。另有实验报道用AF64A直接向NBM注射，造成胆碱能功能损害来建立AD模型[21]。用AF64A制做的AD模型表现为胆碱能系统和记忆功能损害，但不影响非胆碱能神经元，这点优于兴奋性神经毒氨基酸。然而，用此方法也不出现老年斑和神经原纤维缠结形成的组织病理学改变。
　　1.3 192IgG-Saporin
　　近年Lappi和Gary等人用192IgG-Saporin向大鼠侧脑室有前脑基底区注射进行有关AD的研究[22-23]。192IgG-Saporin是一种抗神经免疫毒。用其向大鼠脑内NBM注射，可选择性损害与基底前脑核有关的乙酰胆碱系统，如内侧隔区、斜角带，同时出现记忆减退的表现，但仍然不能出现AD所特有的其它组织病理学改变。
　　1.4喹啉酸（Quinolinic acid,QUIN）
　　喹啉酸是一种兴奋性神经毒素。1995年宋前流等人用其注入海马CAI区，通过其选择性破坏谷氨酸（Glu）能神经元，拟制成Glu能损毁的AD模型。本模型的制做是基于Maragos提出的AD-Glu假说[24]。喹啉酸为Glu类似物，是脑内潜在的内源性兴奋性毒素[25]，当以较高浓度应用于细胞时，产生与海人酸和鹅膏蕈氨酸相似的病理和生化改变，实验表明，其可引起大鼠空间辨别能力和学习记忆障碍。但是它能否导致其它组织病理学改变未见报道。
　　1.5东莨菪碱（Scopolamine）
　　东莨菪碱是一种抗胆碱能药。东莨菪碱可阻断大脑皮层中的乙酰胆碱受体的结合位点，从而引起胆碱能系统功能障碍。Caulfield等将东莨菪碱注入小鼠、大鼠、猴等哺乳动物的侧脑室进行了有关乙酰胆碱功能及AD方面的研究[26]。与神经毒氨基酸和AF64A比较，此方法建立的AD模型主要是出现与AD一致的记忆、认知功能障碍，有关AD特有的组织病理学改变是否发生未见文献报道：据文献提示东莨菪碱引起的胆碱能功能损害可逆转，而AD是一种慢性、进行性不可逆转的神经性疾病。所以用此方法不能完全模拟出AD的各种特征。
　　1.6铝元素中毒
　　正常人脑组织铝的含量1.8±0.8μg/g（干重）或1.22μg/g（湿重），正常大鼠脑内铝含量为1.1μg/g（干重）[27-28]。已被公认，铝在体内一些部位的异常蓄积可产生毒性作用。早在1937年Scherp和Church就提出铝可引起神经元退化的看法[28]。1965年Klatzo和Terry等提出铝中毒可能与AD发病有关，他发现AD病人与铝中毒病人脑中均可见NFT[3]。此后1973年Crapper等人提出铝可能是神经毒素，他们给猫脑内直接注射铝盐，发现铝具有神经毒素样作用，导致神经纤维变性[4]。国内有学者采用给大鼠或小鼠腹腔注射及口服铝盐建立AD模型[29]，结果模型鼠出现大脑重量减轻，学习记忆减退的表现。临床资料表明AD病人脑内铝含量显著高于正常值[30]；血清铝的水平也明显高于对照组[31]。纵观有关铝与AD的实验研究，已基本肯定：AD病人脑内铝的含量明显超过正常值；铝对中枢神经系统有毒性损害，使神经元变性或死亡，产生NFT病理性改变，继而表现为大脑皮质萎缩，脑重减轻；出现记忆、认知功能障碍。至于铝与β-AP之间关系的研究尚未见文献报道。我们进行了有关铝和β-AP关系的研究，结果表明铝可以引起β-AP在脑内沉积和β-APP在神经元的过度表达[32-33]。因此，我们认为，用铝诱导建立AD模型的方法较好。缺点是此种AD模型出现的NFT与AD病人的略有差异，再就是用铝造模周期长（口服约三个月）。
　　2 物理方法一断开穹窿海马伞通路
　　早在1954年，Daitz等人就采用横断穹窿海马伞系统来研究观察神经元的退化过程。后来人们为了进行AD方面的研究，采取了真空抽吸、横断或电解等方法损毁单侧或双侧穹窿海马伞通路建立AD模型[34-35]。此种方法主要是通过切断隔海马通路（如扣带束、背穹窿海马伞），破坏胆碱能及非胆碱能纤维传入，导致实验动物行为及神经化学方面的缺损，造成动物空间定向和记忆障碍及胆碱能神经元的丢失。1994年Jeltsch等的实验研究结果表明，切断双侧穹窿海马伞通路造成的AD模型在数月后，其行为及神经化学的缺失也不能恢复[36]。用此方法建立AD模型，周期短（约两周），但手术定位难以控制，很难避免手术区邻近组织的受损。
　　3 转移基因小鼠 
　　关于转移基因小鼠的研究始于八十年代末，1991年Quon等人先后进行了有关报道[37]。在1993年第23届美国神经科学年会上Felenstein等报告了建立转移基因大鼠模型。1995年美国Athena neurosiences Inc and Eli Lilly & Co.公司宣告用遗传工程方法建成了AD动物模型，即转移基因小鼠。他们采用人体异常APP的基因向小鼠胚胎细胞插入而建立的。APP基因是编码淀粉样蛋白的基因，这种蛋白在体内能释放出β-AP，β-AP在AD患者脑内老年斑中大量存在。与上述所有方法相比，此种模型能较好模拟出与AD有关的记忆损害和形态变化。但迄今为止，只证明转移基因小鼠脑内可见淀粉样蛋白和出现记忆的损害，尚未观察到淀粉样斑块和NFT[39]。但是，毫无疑问，采用基因技术是目前建立AD模型最先进且具有广阔前景的手段。
　　4 老年动物
　　老年动物可出现学习记忆减退，脑组织出现淀粉样斑块和NFT的病理改变，这与AD病人是一致的。故是研究AD较好的动物模型。但存在以下缺点：①老年动物神经系统的发病与AD的发病过程和机制不完全一致，因此神经化学方面的改变也是不同的。②体质差，易死亡，故不宜用于周期长的实验。③对药物的吸收代谢不佳。④价格昂贵。
　　综上所述，每种建立AD模型的方法各有其优缺点，尚无一种公认最理想的方法，还有待于进一步的研究和探索。目前国内外采用较多的是用神经毒氨基酸损毁NBM、横断穹窿海马伞通路、铝诱导建立AD模型，其次，较新的方法就是用转移基因小鼠或大鼠模型。　
郑观成，脑老化与老年痴呆，第一卷，第1版，上海，上海技术文献出版社，1994，185 
Pericak-Vance MA,Bebout JL,Gaskell PC,et al.Linkage studies in familial Alzheimer disease:evidence for chromosome 19 linkage,Ame J Hum Genet,1991,48(5):1034 
Klatzo I,Wishiewski H,Streicher E,Experimental prduction of neurofibrillary degeneration.J Neuropath Exp Neurol,1965,24:187 
Carpper DG,Krishnan SS,Dakton AJ,Brain aluminum distribution in Alzeimer’s disease and experimental neurofibrillary degeneration.Science.1973,180(4085):511 
Davies P,Maloney AJF.Selective loss of central cholinergic nuerons in Alzheimer’3 disease.The Lancet,1976,2(8000):1403 
Bowen DM,Smith CB,White P,et al.Neurotransmitter-relat-ed enzymes and indices of hypoxia in senile dementia and other abiotrophies,Brain,1976,99(3):459 
Cambell IL,Abraham CR,Masliah E,et al.Neuologic disease induced in transgenic mice by cerebral overexpression of interleukin 6.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:10061 
Dek-Bo R,Angeretti N,Lucca B,et al.Recirocal control of inflammatory cytokines.IL-1 and IL-6,and beta-amyloid production in cultures,Neurosci Lett.1995,188:70 
钱连华，华于静，陈茨海默病传染学说，国外医学（老年医学分册），1994，15（1）：11 
Brenner DE,Kukull WA,Stergachis A,et al.Postmenopausal estrogen replacement therapy and the risk of Alzheimer’s disease:a population-based case-control study.Am J Epidemiol,1994,140(3):262 
Kowall NA,Beal MF,Busciglio J,et al.An in vivo model for the neurodegenrative effects of βamyloid and protection by substance P,Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(16):7274 
Wade R,New lesion fornd in diseased brains .Science,1997,277:31 
Ben-Ari Y,Tremblay E,Ottersen OP,et al.The role of eplieptic activityin hippocampal and remote cerebral lesions induced by kainic acid.Brain Res,1980,191:79 
Sofroniew MV,Pearson RCA,Degeneration of choliergic neurous in ghe basal nucleus following kainic or N-methyl-D-aspartic acid application to the cerebral cortex in the rat.Brain Res,1985,339(1)1:186 
Hastings MH,Winn P,Dunnett SB,Neurotoxic amino acid lesions of the lateral hypothalamus:a parametric comparison of the effects of ibteate.N-metyl-D L-aspartate and quisqualalate in the rat.Brain Res,1985,360:248 
Dunnett SB,Whishaw IQ,Jones GH,et al.Behavioural,biochemical and histochemical effects of different neurotoxic aminoacids injected into nucleus basalis magnocellularis of rats.Neuroscience,1987,20(2):653 
Coyle J,Mckinney M,Johnston M,et alSynaptic neurochrmistry of the basal forebrain cholignergic projection.Psychopharmacol Bull,1993,19:441 
Wenk G,Olton D,Recovery of neocortical choline acetyltrans-ferase activity following iboteic acid injection into the nucleus baalis of Meynert in rats.Brain Res,1984,293:184 
郑观成，脑老化与老年痴呆，第一卷,第1版，上海，上海科学技术文献出版社，1994，127 
Mantione CR,Zigmond MJ,Fisher A,et al.Selective lesioning of rat hippocampal cholineergic neurons following localized injection of AF64A,J Neurochem,1983,41:251 
Arbogast RE,Kozlowski MR,Reduction of cortical choline acetyltransferase activity following infections of ethlcholine mustard aziridinium ion(AF46A)into the nucleus basalis of Meynert,Soc Neurosci Abstr,1984,10:1185 
Wiley RG,Berbos TG,Deckwerth TL,et al.Destruction of the cholinergic basal forebrain using immunotoxin of Alzheimer’s diseases.J Neurol Sciences,1995,128:157 
Gary LW,James DS,George Q,et al.Behavioral ,biochemical,histological ,and electrophysiolgical effects of 192 IgG-saporin infections into the basal forebrain of rats.J Neurosci,1994,14(10):5986 
宋前流，宋瑞义，参归煎剂抗痴呆作用与谷氨酸的关系，中成药，1995，17（6）：28 
Stone TW,Perkins MN,Quinolinic acid:A potent endogenous excitant at amino acid reeptors in CNS,Eu J Parmacol,1981,72;411 
Caulfield MP,Fortune DH,Rowvrts PM,et al.Intracere-broventricular hemicholinium-3(HC-3) impairs learning of a passive avoidance task in mice,Bri J Pharmaco,1981 ,74(4):865 
Bartus RT,Dean RL,Beer B,et al.The choliergic hypothesis of geristric memory dysfunction .Science,1982,217(4558):408 
秦俊法,微量元素与脑功能,第1版,北京,原子能出版社,1994,52 
李文彬,张炳烈,马向晨等.吡乙酰胺对三氯化铝中毒大白鼠回避反应受损的对抗作用.药与毒理学杂志,1988,2(2):132 
Perl DP,Brody AR,Alzheimer disease X-ray spectrometric evience of aluminum accumlation in neurofibrillary tanglebearign neurons .Science,1980,208(18):297 
刘成铮,陈光,途格晟,等.Alzheimer型老年性痴呆与铝的关系.临床神经病学杂志,1994,7(1):37 
胡海涛,钱亦华,杨杰，等.淀粉样前体蛋白在痴呆模型大鼠背海马结构的表达,解剖学杂志,1997,20(5):444 
钱亦华,杨杰,任惠民,等.痴呆模型大鼠背海结构内淀粉样蛋白沉积的免疫细胞化学研究,西安医科大学学报,1997,18(30:304 
Gage FH,Bjorkund A,Stenevi U,Reinnervation of the partially deafferented hippocampus by compensatory collateral sprouting from spared cholinergic and noradrenergic afferents.Brain Res,1983,268:27 
Dunnett SB,Neural transplantation in animal models of dementia.Eur J neuroaci,1990,2:567 
Jeltsch H,Cassel JC,Neufang B,et al.The effects of intahip-pocampal taphe and/or septal grafts in rats with fimbria-fornix lesions depend on the grafted tissue and the behavioural task used .Nueroscience,1994,63(1):19 
Quon D,Wang Y,Catalano R,et al.Formation of β-amyloid protein deposits in brains of transgeoic mice .Nature,1991,352:239 
孙延昌摘译,Alzheimer 病的动物模型,国外医学(老年医学分册),1996,17(3):80 
Robertson M,Alzheimer’s disease and amyloid. Nature,1992,356:103