骨组织工程的进展

关键词： 骨组织工程 进展 

　　人体由于疾病（中毒、感染及先天畸形）和外伤、肿瘤等原因所造成的组织、器官的缺损及功能的丧失，可通过移植各种替代物加以修复。替代物包括自体组织、同种异体组织、异种组织和人工合成物质。虽然这些替代物均已应用于临床，但不可避免地存在着种种问题及局限性，这就迫使整形外科及相关学科的工作者寻求更为合适、有效的替代物。近二十年来，由于组织类型培养技术的普及，细胞生物学、分子生物学、生物化学等学科的和生物医学材料的开发及利用，产生了一门新的学科——组织工程学（Tissue enigeering）.
　　1 组织工程学概况
　　组织工程学是应用生物学和工程学的原理，研究开发能够修复、维持和改善损伤组织功能的生物替代物的一门学科[1]。其基本方法是将体外培养的高浓度的功能相关的活组织细胞扩增，并种植于一种生物性能良好、生物可降解性（或称生物可吸收性）的天然与人工合成的细胞外基质（Extracelluar matrix. ECM）上。然后将它们共同移植到所需部位，在机体内细胞继续增殖，而生物支架结构则逐渐被降解、吸收，结果形成新的有功能的组织器官，而达到修复结构、恢复功能目的[1～5]。目前，组织工程学包括以下几个方面的研究：①ECM开发；②种子细胞生物学性质；③组织工程化组织对病损组织的替代。组织工程学涉及各种组织和器官。各方面的研究均取得了一定的进展[1，2，4]。
　　2　骨组织工程的研究
　　1995年Crane GM系统提出了骨组织工程的概念、研究方法、研究现状及发展前景，引起了广大学者的关注[4]。近年来骨组织工程在以下几方面的研究取得了令人瞩目的进展。
　　2.1　ECM替代物的开发
　　ECM是稳定组织结构的一种相对惰性的支架结构，但它在调节与其相联系的细胞行为方面却起着十分积极和复杂的作用。ECM的成分包括不同类型的胶原蛋白、各种蛋白多糖、弹性蛋白及一些粘连蛋白。
　　骨组织工程研究重点是寻求能够作为细胞移植与引导新骨生长的人工合成与天然的支架结构，作为ECM的替代物。这种支架结构需具有以下特点：①良好的生物相容性、生物可降解性；②良好的骨诱导性和骨传导性；③具有负荷最大量细胞的高渗透性；④支持骨细胞生长和功能分化的表面化学性质与微结构；⑤可与其它活性分子如骨形态发生蛋白（BMP）、转移生长因子-β（TGF-β）复合共同诱导骨的发生；⑥易消毒性[1，4]。
　　ECM包括人工合成的ECM和天然ECM（Nature extracellular Matrix,NECM）.
　　2.1.1人工合成的ECM　目前使用的人工合成的ECM大多为聚合物（polymer）。聚乳酸（polyletic,PLA）和聚羟基乙酸（polyglycolic acid,PGA），是最常用的两种ECM替代物。近来聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物（polylactic-co-glycolic acid PLGA）得到了深入的研究。其它聚合物还有多聚羟基酸、聚酣、聚亚胺、聚偶磷氮、胶原等。具生物活性的玻璃陶瓷（bioactive glass ceramics.BGC）、羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）、钙磷陶瓷（calcium phosphate ceramic）即羟基磷灰石和磷酸三钙（HA/TCP）也可用于骨组织工程。它们具有良好的组织相容性、生物降解性、骨传导性[6～8]。羟基磷灰石骨水泥（hydroxyapatite cement, HAC）或称磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement, CPC）由于具有易于塑形、自固化能力、与成骨相协调的降解活性等独特优点而日益受到重视。1991年美国食品与药物管理局批准进行HAC人造骨临床试用，修复颅面部非负重区骨缺损，结果满意的恢复了结构的完整性[9]。
　　珊瑚是一种海生无脊椎动物的骨骼，其化学成分99%为碳酸钙，还有少量其它元素和有机成分，类似无机骨。采用经特殊理化处理的珊瑚人工骨，其微孔道结构有利于骨组织长入和替代，是一种良好的骨替代品[10～11]。但珊瑚人工骨质地脆，吸收快，植入后有一定体积丧失，而限制了它的使用。
　　金属、胶原、明胶、脂质体等作为ECM替代物也有报道。人工合成的ECM对人体来说仍是异物。植入体内，可引起不同程度的炎性反应，也存在免疫原性问题，致癌性问题。
　　2.1.2 NECM的研究　为了解决人工合成的ECM所带来的问题许多单位已着手进行NECM的研究工作。天然无机骨采用动物骨，经物理、化学及高温处理，除去其有机成分，保留无机成分的三维结构外型。其主要成分为羟基磷灰石，具有新生骨出现早、生长快、成骨量多的特点。脱钙骨基质于1965年由Urist首先研制成功，可诱发异位成骨。在脱钙基础上去除磷蛋白、涎蛋白、和蛋白多糖等大量非BMP物质，而制成了骨基质明胶，它比DBM有更强的骨诱导能力。辽宁省人民整形科用组织工程学方法制备了动物（猪、牛、兔）皮肤、骨、软骨、肌腱的NECM，经检测证明处理后的组织仅剩下胶原支架，他们将兔耳ECM应用于软骨组织工程研究，证明可复制出新的软骨。这为骨NECM用于骨组织工程研究提供了线索[11，22]。NECM必将加快骨组织工程的研究。
　　2.1.3 复合材料的开发 上文提及的各种替代物单独作用的成骨能力有限，为了增强其成骨能力，近二十年来人们已经开始用人工复合材料进行骨诱导。骨髓细胞具有骨诱导性，且本身有成骨活性，但单独移植后成骨效果不理想。Grundel rE等采用多孔双相钙磷陶瓷和骨髓复合修复骨缺损的效果比单纯骨髓移植好[8]。
　　生物性和非生物性材料，如HA、BGC、无机骨、胶原等均可与BMP或生长因子（GF）复合修复骨缺损，其具有良好的骨传导与骨诱导双重作用，成骨作用显著大于单纯材料组。目前有学者提出理想的骨移植材料应是适宜的支架的材料、BMP、GF的复合，并取得了初步的成功。
　　2.2　种子细胞的开发
　　骨的生成是由成骨细胞向周围分泌基质和纤维，将自身包埋于其中，形成类骨质，有钙盐沉积后变成骨组织而完成的。因此成骨细胞是骨组织工程的种子细胞。目前种子细胞的来源主要有骨外膜、骨髓、骨、骨外组织。
　　2.2.1 骨外膜 骨外膜中含有骨原细胞、成纤维细胞、成骨细胞和破骨细胞。骨原细胞保持着分化潜能，可被激活增殖分化为成骨细胞。取骨外膜培养可分离出成骨细胞。1991年Haruhiko nakahaka等取幼鸡胫骨骨膜，酶解后进行培养，经检验证实其具有分化为成骨细胞的潜力[13]。Vacanti cA等将骨膜来源的成骨细胞培养后种植与PGA上孵育7～10天后，上清液中有骨钙存在[14]。 puelacher等取牛骨外膜细胞培养并种植于生物可吸收性聚合物纤维结构上，形成细胞-多聚物复合体，还将复合体移入12只裸鼠的额部缺损，对照组未出现修补或仅覆以聚合物。12周后，实验组有骨痂形成，对照组则无明显骨发生[15]。优点：具有很强的繁殖和分化为成骨细胞的能力，易存活。缺点：供区组织的损伤。
　　2.2.2骨髓　骨髓成骨能力来自于骨髓基质细胞中的纤维细胞集落形成单位，它具有多向分化潜能，可分化为成骨系细胞、成纤维系细胞、脂肪细胞和网状细胞。在诱导因子作用下，可使其向成骨细胞系分化的数量大大增加，表明骨髓基质具有很强的成骨潜能[16，17]。MartinⅠ等取鸡胚骨髓基质细胞在体外培养，分化出软骨及骨样组织[18]。
　　优点：取材容易，损伤较小，传代能力强。缺点：因基质细胞具有多种分化潜能，应选择适当培养条件，保证其向成骨细胞分化。
　　2.2.3骨　胚胎与新生动物骨及人胚胎骨经培养得到成纤维细胞样细胞，适当条件可进一步分化为成骨细胞。Riccio v等将从人胚胎颅盖骨所取得的成纤维细胞样细胞在体外培养，发现细胞聚有很强的传代能力，34小时可传代一次。经分析，所得细胞是聚有很强分化能力的成骨细胞，且能与生物材料复合继续生长分化，生成新骨[19]。优点：易定向分化为成骨细胞。缺点：供区损伤及来源的局限性。
　　2.2.4骨外组织 起源于胚胎时期间充质的骨外部位的骨祖细胞，在诱导因子的持续作用下可维持其成骨的功能。如周皮细胞、C212成肌细胞、成纤维细胞等。家兔皮肤的成纤维细胞在体外培养，不仅能产生粘多糖和胶原等基质成分，还有钙盐沉积，有新生骨组织形成，证明皮肤成纤维细胞在体外有成骨的潜能[20]。优点：取材容易、创伤小，传代繁殖快。但其适应受区环境的能力较差。
　　综上所述，种子细胞应具备以下特点：①体外培养易定向分化为成骨细胞，传代繁殖快；②适应受区环境能力强；③取材容易，损伤小。根据四种来源的优点和不足，骨外膜和骨髓是比较理想的种子细胞来源，很有研究的意义。
　　2.3　组织工程化骨的组织还原
　　目前组织工程化骨修补缺损的实验过程，从取材、体外培养、细胞一聚合物复合体形成得到了成功。Breitbart aS等运用体外培养的骨膜细胞种植于PGA无纺网支架，移入体内修复颅骨缺损，证明了组织工程化骨可用于修补骨缺损[21]。国内有用羟基磷灰石水泥、珊瑚人工骨、BGC等修复颅面部缺损，效果良好。
　　2.4　生长因子与骨组织工程
　　随着分子生物学、生物化学的深入研究，生长因子在骨形成中的作用的日益受到重视。多种生长因子参与骨形成过程。生长因子通过调节细胞增殖。分化过程并改变细胞产物的合成而作用于成骨过程，因此，在骨组织工程中有广泛的应用前景[22，23]。常用的生长因子有：成纤维细胞生长因子（FGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、胰岛素样生长因子（IGF）、血小板衍化生长因子（PDGF）、骨形态发生蛋白（BMP）等。它们不仅可单独作用，相互之间也存在着密切的关系，可复合使用。生长因子的作用是一个复杂的过程：如TGF-β、BMP的作用具有时间依赖性、剂量依赖性，针对不同分化阶段的靶细胞起不同的作用[24，25]。生长因子在骨组织工程中的应用，还需更深入的研究，以期取得最好的效果。
　　2.5　骨组织工程发展前景及所存在的问题
　　随着技术的发展、骨组织工程将成为一个项非常有前途的研究项目。近二十年来的研究成果已经给整形外科、口腔颌面外科、手外科医师提供了治疗骨缺损的新希望，尽管体外合成的骨组织在动物实验中可在动物体内存活，但日前尚不能应用于临床。主要原因有：①还原组织不能完全替代病损的功能，特别是负重部位的功能替换，涉及生物力学，移植效果尚难确定；②体外培养的组织能否适应体内环境继续生长还未得到确实的证明，体外培养液是一种优化培养环境，不受其它因素干扰，而体内骨的愈合需受神经、体液、周围环境的影响。③用于临床治疗，手术费用较高，患者难以承受[1]。
　　骨组织工程在近几年中需深入研究的问题：①继续完善动物实验机制，得到确实可靠的证据，为临床实验铺平道路；②骨生成和形态发生的影响因子的研究，与其它基础学科相联系，以确定哪些因子能有效促进新骨形成及影响其发挥最佳作用的因素。③深入ECM和种子细胞的开发，寻求更为理想的替代物和细胞来源。
　　组织工程学是医学科学发展的前沿学科，作为其中组成部分的骨组织工程有发展的潜力。随着研究的深入，相关科学技术的发展、进步，骨组织工程会更加完善，给医学领域特别是整形外科、口腔颌面外科带来巨大的变化。
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