关于肿瘤敏感基因TSG101的分子生物学研究进展

关键词： tSG101；泛素结合酶 

　　摘要　 iSG101是近来发现的一个从酵母到人高度保守的蛋白家族。其 n端与泛素结合酶（ uBC）有一定的同源性。有研究表明： tSG101的转录子在某些肿瘤细胞中发生了异常剪接； tSG101可能有转录因子的作用； tSG101也有可能作为一种显性负调节子参与泛素系统对细胞周期的调节。

　　1996年， li等用随机纯合子剔除法（ random homozygous knock out， rHKO）［用转录激活启动子的反义 rNA随机地引入基因组转录的基因中以剔除与启动子插入部位相邻近的等位基因］在 nTH3T3成纤维细胞中发现一个新基因（1）。该基因的功能失活可引起细胞转化；将该转化细胞注射在裸鼠皮下，可形成肿瘤并伴有转移；将该基因功能恢复，转化的细胞又可部分逆转。该基因被命名为 tSG101（ tu-mor-Susceptibility gene101）。
　　随后，他们又克隆到人的 tSG101基因（2），并进行了该基因在染色体上的定位。之后，人们对 tSG101基因进行了一系列研究，现将其综述如下：
　　1　人 tSG101基因（ hTSG101）
　　hTSG101基因的 cDNA（2）有1494个 bp，与小鼠的有86％同源，含1140bp的开放读框，编码一由380氨基酸组成的蛋白质。
　　该基因有6个外显子。外显子1内可能还含有一个具有 ecoR1限制性位点的内含子（3）。定位于染色体11p15．1－ p15．2。较肿瘤抑制性亚染色体可转移 dNA片段（ subchromosomal transferable DNA frag-ment）更靠近着丝粒，并且较 d11S860遗传标记更近着丝粒6Mb以上（4）。
　　已知在多种类型的人类恶性肿瘤如乳腺癌， wilm氏瘤，肺癌，膀胱癌，睾丸癌，肾上腺皮质瘤，肝胚细胞瘤，卵巢癌中，染色体11p15区带或其邻近的区域经常发生杂合性丢失（ loss of heterozygosity）。此外，研究发现：将正常的11号染色体或其片段导入乳腺癌细胞，可以逆转癌细胞的转移倾向以及其他的一些恶性特征，提示在11号染色体的长臂上可能含有一个肿瘤抑制基因，其突变参与人类肿瘤，尤其是乳腺癌的发生。小鼠的 hTSG101同源基因 tsg101的功能失活可使 nTH3T3成纤维细胞转化为具有转移性的癌细胞，提示 hTSG101基因是否就是这种可抑制肿瘤发生的基因。
　　①本文受国家基金（编号为39830210)资助
　　li等（2）对15例乳腺癌的 cDNA进行分析，发现其中7例的 tSG101cDNA存在序列缺失。这7例中有6例的基因 dNA存在较大的片段缺失，缺失片段的大小范围在7．4－16．4kb左右。此外，在1例乳腺癌的 tSG101基因 dNA中，在其编码卷曲螺旋结构域（ coiled-coil）的片段上，还存在一个 i→ c的点突变。
　　但 steiner等（3）通过对46例乳腺癌组织和13个乳腺癌细胞系的 dNA直接进行分析，发现 tSG101基因 dNA中并不存在上述大片段缺失。此外， zhong等（5）也在10种乳腺癌细胞系中找到了完整的 tSG101蛋白质，亦表明其编码基因是正常的。 lee等（4）在研究中发现：（1）对72例乳腺癌进行基因组 southernBlot分析，未发现 tSG101基因有基因内缺失。（2）对12例没有基因内缺失的乳腺癌的 cDNA进行分析，发现其中的5例除了有全长的 tSG101cDNA外，还有几种截短的 cDNA片段。这些 cDNA片段缺失的类型共归为6类（ a， b， c， d， e， f型），其中以 a型最为普遍。还发现这些缺失的 cDNA片段具有较一致的剪接供体序列和剪接受体序列。（3）在4例配对的正常乳腺组织中，有3例存在 d型的转录子；在2个胎儿的各种组织（心，胃肠道，肺，舌，皮肤，肾，脑）中，也发现了 a， b， d型的转录子。不过正常乳腺组织和胎儿组织中，这些截短的转录子的数量比乳腺癌中的相对更低许多。这些情况提示：并非是基因内的缺失，而是 mRNA的异常剪接造成了乳腺癌中 hTSG101基因转录子片段缺失。 gayther等（6）对一些恶性肿瘤， eB病毒无限增殖化 b细胞和正常肺间质组织的 dNA， rNA进行分析，也得到了相似的结果：在各种样本中，都存在不少的 tSG101转录子片段缺失的情况，片段缺失的断裂点也是与一些隐蔽的剪接位点相一致的；而这些样本的 dNA分析却难以找到与这些转录子缺失相对应的改变。 sun等（7）在4例前列腺癌中发现有6种不同的转录子片段缺失情况，其中最普遍的一种缺失与 lee等所发现的最普遍的缺失类型－ a型（ bp153－1055）是一致的。
　　由此可以认为： hTSG101基因在肿瘤发生中并没有发生改变，而是其转录子的剪接出现了异常，全长转录子减少，使其表达减少。
　　2　 hTSG101蛋白质
　　hTSG101基因编码的 h－ tSG101蛋白，含有380个氨基酸，分子量42．84kDa。
　　h－ tSG101蛋白与小鼠 tSG101有94％的同源性。两者之间只存在20个不相一致的氨基酸和一个间隙。一个卷曲螺旋结构域（ h－ tSG101氨基酸231－301）和一个富含脯氨酸的区域（ h－ tSG101氨基酸130－20532％脯氨酸）在 h－ tSG101与小鼠 tSG101两者间是高度保守的，分别只有1个氨基酸和3个氨基酸不一致。卷曲螺旋结构域中的亮氨酸接链元件在两种蛋白质间是相同的。在小鼠 tSG101与 h－ tSG101两者间一致的位点还有7个假定蛋白激酶 c磷酸化位点（氨基酸11，38，86，89，215，357）；5个可能的酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点（氨基酸38，210，249，265，290）；以及3个潜在的 n－糖基化位点（氨基酸44，150，297）。这么多的磷酸化位点可能说明 h－ tSG101的功能是受磷酸化调节的。
　　3个独立的 dNA结合域（1）：卷曲螺旋结构域中的亮氨酸拉链元件、一条与噬菌体受体的螺旋—转折—螺旋结构域相似的片段（氨基酸37－46）和一个锌一半胱氨酸锌指双核簇特征结构域（氨基酸73－83）以及在亮氨酸拉链元件的附近存在一个富含脯氨酸区域，提示 hTSG101可能具有转录因子的作用（2）。
　　此外， hTSG101中保守的卷曲螺旋结构域一个可与 statlmin相互作用的蛋白相似（2）。 stathmin又名癌蛋白18，是一个磷酸化蛋白，对调节细胞增殖和分化的信号有协调和后延作用。 hTSG101可能的转录作用可能是由 stathmin通过磷酸化作用进行调控的。
　　hTSG101在细胞中的分布具有细胞周期依赖性（9）。 g1早期， hTSG101主要分布在细胞核及核周的高尔基复合体。之后，逐渐向胞质扩散。至 s期晚期，遍布整个胞浆。在进入有丝分裂后， hTSG101主要分布在有丝分裂器上，如中心粒、有丝分裂纺锤体。 hTSG101这种在细胞周期中穿梭于不同部位的能力，表明 hTSG101可能在细胞的多个位点发挥不同的作用。 hTSG101这种周期依赖性分布特征与一些调节细胞增殖和／或细胞发育的蛋白是相似的，如周期蛋白依赖性激酶、钙一钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ、以及周期蛋白 b1和 b2等。
　　hTSG101的 n端（氨基酸134）与泛素结合酶（ uBC）有明显的同源性（10，11），三维结构的比较也发现， tSG101与 uBC有很高的一致性：除了 tSG101在 c端缺少2个螺旋外，共他的结构单位都很相似（10）。 uBC结合泛素的活性半胱氨酸残基在 hTSG101中被酪氨酸残基代替，但其周围的保守氨基酸残基仍能形成一个疏水基团，这使 hTSG101能保持一个与 uBC具有相同构象的活性多肽环。 hTSG101虽然缺少了2个 c端螺旋，但这两个螺旋并没有接触到活性位点，不影响配体与蛋白质的结合。因此， hTSG101似乎也是参与泛素系统的一种新的调节蛋白，它以 uBC的显性负性变体（ dominant negative variant）的形式起作用（10－12）。
　　因为 hTSG101分布活动与一些参与细胞周期调节的蛋白相似， hTSG101可能作为一种显性负调节子参与泛素系统对细胞周期的调节，可能通过与泛素靶蛋白或泛素系统中的其他成份形成无效复合物来实现这一调节作用（10）。
　　xie等（9）发现缺失 hTSG101的 sL6细胞出现了一系列与有丝分裂有关的异常情况，包括多微管组织中心、异常的有丝分裂纺锤体、分裂中期染色质的异常分布、非整倍体、核异形等。这些异常可以通过恢复 hTSG101的正常表达加以逆转。已知 dNA的修复缺陷，细胞周期的缺陷，细胞周期检查点的异常都可导致基因组的不稳定性。似乎可以认为：某些原因（如 hTSG101转录子的异常剪接）使正常 hTSG101表达减少，造成有丝分裂的异常，从而使基因组不稳定，促成肿瘤的发生。 hTSG101缺乏导致有丝分裂异常，这似乎与 hTSG101假定的细胞周期调节作用是一致的。
　　li等（1）发现，对于经 tSG101基因失活处理而发生恶性转化的 nTH3T3成纤维细胞，虽经恢复 tSG101基因活性，部分细胞的恶性转化并未逆转。这可能说明 tSG101基因产物也许对有丝分裂起到看守者（ caretaker）的作用，它的失活可以增加基因组的不稳定性，从而增高各种基因发生突变的机率。而 hTSG101在有丝分裂中主要分布在各种微管系统中。
　　由此可见， hTSG101的作用是多样的，这些作用究竟是反映了 hTSG101的多种独立的功能，还是 hTSG101的一种功能参与了多种酶调节系统作用的结果，还有待于进一步研究，此外， wang等（13）对189例原发浸润性乳腺癌和59例转移性乳腺癌的研究发现， hTSG101基因的基因内缺失以及转录子的片段缺失在乳腺癌中是很少发生的。所以， tSG101基因的基因改变与肿瘤发生的关系，以及转录子剪接异常发生的机制都还需进一步的探究。
　　tSG101在酵母中的同源蛋白 yCL008C（14）也已发现。这说明 tSG101可能形成一个从酵母到人的保守的蛋白家族。该蛋白家族的特征是：其 n端与 uBC有一定的同源性，但不具有 uBC所必需的用以与泛素结合的活性半胱氨酸残基。近来，人们又发现了一个新的类 uBC蛋白家族一泛素结合酶变体蛋白（ uEV）（15，16）。 uEV蛋白与 tSG101相似，同 uBC也有较高的同源性，但也不具有 uBC所必需的活性半胱氨酸残基。但是 uEV蛋白与 tSG101蛋白是两个不同的蛋白家族，它们在系统发育上与 uBC具有相同的距离。 uEV蛋白参与调控细胞分化，细胞周期和 dNA修复（10，15－17），提示 tSG101是否也参与这些过程的调节，而 tSG101对泛素系统的显性负调节作用以及其与肿瘤发生的关系，也提示 uEV也可能以显性负调节的方式参加泛素系统的作用， uEV蛋白也可能与肿瘤发生有关。 tSG101和 uEV这两个类 uBC蛋白家族的出现，将有利于我们了解泛素系统的一些尚未发现的代谢调节作用。