利用组织工程技术再生软骨组织的实验研究

关键词： 细胞；软骨；再生；组织工程 

　　【摘要】　目的　在有免疫力的动物体兔体内探索组织工程化软骨生成的影响因素。　方法　经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架与软骨细胞体外培养，观察基质产生情况，并将细胞支架复合物体内回植，观察软骨的生成，并进行组织学及超微结构评价。　结果　以卵磷脂、多聚赖氨酸及聚乳酸共同修饰的聚羟基乙酸与软骨细胞体外培养，结果基质产生旺盛，体内回植后软骨生成良好。　结论　细胞支架复合物体外培养期间有基质产生，是组织工程化软骨生成的前提条件；以卵磷脂、多聚赖氨酸及聚乳酸共同修饰的聚羟基乙酸支架与软骨细胞复合培养后回植到有免疫力的动物体内可生成组织工程化软骨。

　　The experimental study of morphogenesis of cartilage tissues by means of tissue engineering techniques LIU Yanchun，WANG Wei，CAO Yilin，et al. Department of Plastic Surgery，Shanghai Ninth People?s Hospital，Affiliated to Shanghai Second Medical University，Shanghai，200011

　　【Abstract】 Objective To find the factors affecting the morphogenesis of tissue-engineered cartilage in animals who have inherent immunity. Methods To culture chondrocytes seeded onto polyglycolic acid（PGA） scaffolds coating with different materials，observe the production of matrices secreted by chondrocytes and implant the constructs of chondrocytes and scaffolds into subcutaneous of rabbits.The formation of cartilage were evaluated using histology and electron microscope. Results The chondrocytes produced more matrices when seeded onto PGA scaffolds coating with PLA，LEC and PLYS.The formation of cartilage was excellent when the constructs above were implanted into the subcutaneous of rabbits. Conclusion The more production of matrices，the better formation of tissue-engineered cartiolage；The constructs of chondrocytes seeded onto PGA coating with PLA，LEC and PLYS can form tissue-engineerd cartilage in animals who have inherited immunity.

　　【Key Words】 Cells Cartilage Regeneration Tissue-engineered

　　目前有关组织工程化软骨的研究大部分是在无免疫力的裸鼠体内进行［1］。在有免疫力的动物体内形成组织工程化软骨的研究报道较少，而且目前所用固体细胞培养支架主要是以聚乳酸修饰的聚羟基乙酸，存在着亲水性差，对细胞吸附力弱等缺点［2］。本课题通过不同物质修饰的聚羟基乙酸与软骨细胞体外培养后回植，探讨在有免疫力的动物兔体内组织工程化软骨形成的影响因素，为软骨组织工程技术过渡到临床应用提供理论依据。

　　 材料与方法

　　一、聚羟基乙酸支架的表面修饰

　　将直径15 μm纤维间隔150～200 μm厚度100μm的聚羟基乙酸 （Polyglycolic　acid，简写PGA）无纺网（DAVIS-GECK公司提供）以2％的聚乳酸（Polyglycolic　acid，简写PLA）二氯甲烷溶液包埋固定再分别以1％的卵磷脂（Lecithin，简写LEC）无水乙醇溶液及10％多聚赖氨酸（Poly-1-lysine，简写PLYS）包埋，得到四种经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架；（1）PGA加PLA；（2）PGA加PLA加LEC；（3）PGA加PLA加PLYS；（4）PGA加PLA加LEC加PLYS。支架消毒采用75％酒精浸泡及紫外线照射。

　　二、软骨细胞悬液制备［3］

　　取新西兰大白兔一侧耳廓软骨（兔体重2.0～2.5　kg，雌雄不限）。所取软骨剥去软骨膜，剪成0.1　cm×0.1　cm大小的碎片，以磷酸盐缓冲液（PBS，含青霉素200 U／ml，链霉素200 μg／ml）冲洗两遍，以去除残余血迹。然后加入两倍于软骨体积的Ⅱ型胶原酶（Sigma　公司，3　mg／ml）在37℃恒温振荡器内消化。4～5小时收获细胞1次，2～3次后软骨碎片完全溶解细胞从基质中释放出来。经过滤、漂洗、计数制成细胞悬液，浓度为5×107个／ml。

　　三、培养液用F-12培养基加入10％的小牛血清及青霉素100 U／ml，链霉素100 μg／ml。

　　四、细胞支架复合物体外培养

　　将上述支架分别裁剪成1.5　cm×2.0　cm大小，每个支架中加入细胞悬液250 μl，然后将4种细胞支架复合物分别置入60 mm培养皿中，放入37℃ 5％CO2培养箱中，4小时后加入培养液5 ml，抗坏血酸50 μg／ml，人转化生长因子-bl（TGF-bl，MegaGene公司）10 ng／ml，人碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF，MegeGene公司）2 ng／ml。培养液每3天更换1次。定期在倒置显微镜下观察细胞与支架的吸附、生长繁殖及基质产生情况。

　　五、细胞支架复合物体内回植

　　新西兰大白兔12只，于每只兔背部不同部位皮下种植单纯四种支架及四种自体细胞支架复合物，3个月后取材进行大体、组织学及透射电镜检测观察有无软骨组织生成，并与原耳廓软骨进行比较。

　　结果

　　一、细胞支架复合物体外培养期间观察

　　培养期间倒置显微镜观察及扫描电镜检测见支架1细胞复合物无基质产生；支架2细胞复合物有少量基质产生；支架3细胞复合物于支架纤维间有呈蜘蛛网样分布的基质产生；支架4细胞复合物于支架纤维之间或支架纤维表面有较多呈蜘蛛网样分布的基质产生。

　　二、软骨生成情况观察

　　3个月后对12只兔背部不同部位皮下埋置物进行大体观察及组织学、透射电镜检测，结果如下：单纯支架种植均无软骨生成；支架1细胞复合物回植12个标本中2个有软骨生成，但生成的软骨体积远远小于植入的细胞支架复合物体积；支架3、4细胞复全物回植12个标本均有软骨生成，且生成的软骨体积基本等于支架复合物体积，组织学及电镜检测与原兔耳廓软骨相同。

　　讨论

　　一、细胞支架复合物体外培养期间基质产生情况是评价软骨细胞功能的指标之一。3、4支架细胞复合物体外培养期间基质产生旺盛，说明软骨细胞较好地发挥了功能，主要由于多聚赖氨酸对支架的修饰不仅增强了支架对细胞的吸附性，而且具有促进细胞发挥功能的作用［4］；1、2支架未经多聚赖氨酸包埋，则无或较少有基质产生。

　　二、软骨生成与否及生成量的多少与细胞支架复合物体外培养期间基质产生情况密切相关。支架1细胞复合物体外培养期间无基质产生，故回植后无软骨生成；支架2细胞复合物体外培养期间基质产生较少，故12个标本中2个有软骨生成，且生成软骨体积远远小于细胞支架复合物体积；支架3、4细胞复合物体外培养期间基质产生旺盛，故回植后12个标本均有软骨生成，且生成软骨体积基本等于细胞支架复合物体积，其组织学及电镜检测与原耳廓软骨基本相同。

　　三、以往组织工程化软骨的研究大部分是在无免疫力的裸鼠体内进行，而在有免疫力的动物体内研究报道较少。本实验证明在有免疫力的动物兔体内可形成组织工程化软骨组织，为软骨组织工程技术过渡到临床应用提供了理论依据。 

　　1　Vacanti CA，Upton J.Tissue-engineered morphogenesis of cartilage and bone by means of cell transplantation using synthetic biodegradable polymer matrices.Clin Plas Surg，1994，21：445-448.

　　2　刘彦春，王炜.软骨工程技术及其应用.修复重建外科杂志，1997，11：300-303.

　　3　Klagsbrum　M.Large-scale　preparation　of　chondrocytes.Method　Enzymol，1979，58：560-566.

　　4　刘彦春，王炜，曹谊林，等.包埋后的聚羟基乙酸与软骨细胞体外培养的实验研究.中华显微外科杂志，1998，21：36-38.