FXR1P与Btf相互作用的鉴定*
【关键词】 酵母双杂交系统；蛋白质相互作用；FXR1P
【Abstract】 Objective To identify the interaction between FXR1P and Bcl-2-associated transcription factor 1 （Btf）.Methods Isolate the yeast plasmids from the blue clones，which were received by screening a pretransformed cDNA library in yeast two-hybrid system. And transform them into E.coli Top10 and select transformants with AD/library on LB/Amp+ plates. Then culture the transformants and extract the AD/library plasmids，which were to be transformed into Y187 for ninimating with AH109 transformed with pGBKT7/FXR1. Test the protein interaction by colony-lift fiter assay and sequence the AD/library in the true positive clone.Results The blast result of the DNA sequence suggests that it may be the gene Btf. Conclusion There exists the interaction between FXR1P and Btf.
脆性X综合征是最常见的X连锁智力低下疾病，也是家族性智力低下最常见的原因之一。主要临床表现有不同程度的智力障碍、青春期后巨睾丸，部分患者有面部特征性表现，如长脸、招风耳、高腭弓以及类似自闭症的表现。1991年Verkerk 等［1］从X脆性位点分离并克隆到该病的致病基因：脆性X智力低下1号基因（fragile X mental retardation 1，FMR1），其编码蛋白FMRP的缺失或低表达导致疾病的发生。1995年Zhang Y 等［2］克隆出两个定位于常染色体（3q28和17p13.1）、与FMR1基因非常相似的基因，命名为脆性X相关基因1（FXR-1）和脆性X相关基因2（FXR-2），分别编码FXR1P和FXR2P，它们和FMRP有较高的同源性。有学者运用酵母双杂交体系、免疫亲和层析以及基质辅助的激光解吸电离质谱方法，相继发现了一些FMRP相互作用蛋白，包括脆性X相关蛋白FXR1P和FXR2P、核仁素、核FMRP相互作用蛋白（nuclear FMRP interacting protein，NUFIP）、核糖体蛋白、泛素结合酶9（ubiquitin-conjugating enzyme 9，UBC9）、胞浆FMRP相互作用蛋白（cytoplasmic FMRP interacting proteins，CYFIP）、核苷酸二磷酸激酶亚基B、T/G错配糖苷酶（T/G mismatch-spicific DNA thymine glycosylase，TDG）、82-FIP（82-kD FMRP interaction protein）［3～5］。FXR1P是否也与这些蛋白发生相互作用？还与其他哪些蛋白发生相互作用呢？故筛选并研究FXR1P的相互作用蛋白，不但可以初步了解其功能，还可以为脆性X综合征的发病机制提供新的依据。本文通过进一步验证酵母双杂交文库筛选过程中得到蓝色克隆，确认FXR1P和Btf的相互作用，为FXR1P下一步的功能研究奠定基础，为脆性X综合征发病机制的研究提供新的依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌Top10实验室保存，酵母菌株Y187和AH109购自Clontech公司；质粒pGBKT7和pGADT7购自Clontech公司。
1.1.2 主要试剂 酵母SD培养基，SD/-His/-Leu/-Trp，SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基，X-β-半乳糖苷（X-gal）等购自Clontech公司；醋酸锂购自Sigma公司；其他试剂均国内购买。
1.2 方法
1.2.1 蓝色克隆文库质粒的分离 通过文库筛选我们已经得到了一些蓝色克隆，利用Lyticase酶裂解法提取蓝色克隆的酵母质粒，CaCl2法转化感受态Top10，铺在LB/Amp板上，以阳性菌落提取提取质粒。
1.2.2 酵母感受态的制备 挑Y187单克隆至1ml YPDA液体培养基中，高速振动打散细胞，并将此含有酵母单克隆的YPDA液体培养基转入50ml YPDA 液体培养基中，30℃，230rpm，孵育18～24h，至OD600≥1.5；再将此培养基倒入400ml YPDA 液体培养基中使OD600=0.2-0.3，30℃ 230rpm，振摇至OD600=0.5±0.1；转移此菌液至50ml离心管中，于室温1000×g转速下离心5min，弃上清，无菌TE重悬细菌沉淀；再次离心弃上清后，用新鲜制备的无菌的1×TE/1×LiAc重悬细菌沉淀，准备做转化。
1.2.3 感受态酵母细胞的转化 在每支1.5ml EP 管中加入0.1μg AD/Library 质粒和0.1mg鲑精DNA，混匀；加入0.1ml酵母感受态细胞，振荡充分混匀；加入0.6ml 无菌PEG/LiAc 溶液，高速震荡10s；30℃ 200rpm振摇30min；加70μl DMSO，颠倒混匀；42℃热休克15min，立即置冰浴1～2min；室温14000rpm离心5s，弃上清，0.5ml无菌1×TE缓冲液重悬细菌沉淀；取0.1ml铺亮氨酸缺陷培养基（SD/-Leu）平板上，筛选所需的AD/Library/Y187。
1.2.4 一对一酵母配合 挑取AD/Library/Y187和pGBKT7/FXR1/AH109单克隆同时置于装有0.5mlYPDA培养基的EP管里，震荡充分重悬细胞，30℃ 200rpm 振摇20～24h，取0.1ml 配合混合物铺SD/-His/-Trp/-Leu平板上，30℃倒置培养直至长出克隆。
1.2.5 β-半乳糖苷酶滤膜分析 将长出的克隆挑出划线于SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu平板上，30℃倒置培养直至长出克隆；将一洁净、干燥的滤纸影印在长出克隆的培养皿上，取出后置液氮中10s，室温溶解，再将该滤纸放在另一张预先用Z-buffer/X-gal 浸湿的滤纸上，注意菌落面朝上。放于30℃，观察菌落颜色的变化。
1.2.6 DNA序列测定及分析 以Gal4 Sequencing Primer测定文库中插入片段的序列，确定序列中存在与Gal4激活结构域融合的开放读码框，在GenBank中搜寻与其同源的序列。
2 结果
2.1 AD/Library的分离 从蓝色克隆中分离得到的质粒是混合质粒，其中有BD诱饵质粒，也有AD/Library质粒。由于pGADT7质粒有氨苄抗生素抗性，而pGBKT7质粒有卡那抗生素抗性，所以我们将混合质粒转入大肠杆菌Top10，并在有氨苄抗生素的培养基上筛选含有AD/Library质粒的转化子，扩增后提取AD/Library质粒。
2.2 获得的AD/Library/Y187转化子 酵母菌Y187是营养缺陷型，不能自身合成亮氨酸；而AD/Library质粒有亮氨酸基因，故转化Y187后能在亮氨酸缺陷的培养基（SD/-Leu）上生长（图1）。
图1 AD/Library转化Y187得到的克隆
图2 一对一酵母配对辅的皿
图3 滤膜分析结果
2.3 真阳性克隆的获得 小配合后如果BD质粒和AD质粒发生相互作用，那么配对混合物则不仅会在SD/-His/-Leu/-Trp培养基上生长（图2），且划线于四缺培养基（SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu）平板上也能生长，进行X-gal分析显示为蓝色（图3）。
2.4 序列测定 所得序列于GenBank中进行Blast分析，发现与Bcl-2-associated transcription factor 1 （Btf）一致(图4)。
图4 AD/Library质粒的测序结果
3 讨论
疾病相关基因编码蛋白功能的研究对阐明疾病的发生、机制有重要意义，蛋白在生命活动中并不是孤立的，而是与其他蛋白质相互作用来执行其特定的功能，所以可以通过寻找未知基因编码蛋白的相互作用蛋白来推测该蛋白的功能。为此，笔者用酵母双杂交系统筛选FXR1P相互作用的蛋白。
酵母双杂交系统是近年发展并逐步完善起来研究两种蛋白相互作用的遗传学研究方法［6］。研究证明该系统是筛选和鉴定相互作用蛋白、或者蛋白配体的敏感而有效的研究技术，而且整个筛选过程是在真核细胞内完成的，两种蛋白相互作用环境接近真核细胞内相互作用的环境，对筛选相互作用较弱的蛋白，这种技术的优势显得更为明显。然而酵母双杂交系统成为生物学家研究蛋白相互作用的标准方法的同时，也存在它固有的缺点，容易出现假阳性克隆，所以在用酵母双杂交系统进行文库筛选之后，通过多种方法进行验证排除假阳性是必不可少的。而笔者采用的是一对一酵母配合法，得到真阳性克隆，显示FXR1P 和 Bcl-2-associated transcription factor 1 （Btf）有相互作用。接下来我们还将利用免疫共沉淀技术对其进行验证，进一步确定相互作用的存在。
【】
1 Cerkerk AJ. Identification of a gene (FMR1) containing a CGG repeat coincident with a breadpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell，1991，65: 905-914.
2 Zhang Y，O’ connor JP，Siomi MC，et al. The fragile X mental retardation syndrome protein interacts with novel homlogs FXR1 and FXR2. EMBO J，1995，14(21):5358-5366.
3 陈雨亭，B Bardoni，余珉，等.FMRP与TDG 蛋白的相互作用.通报，1999，44（18）：1981-1986.
4 Bardoni N，Schenck A，Mandel JL. A nomel RNA-bingding nuclear protein that interacts with the fragile X mental retardation (FMR1) protein. Hum Mol Genet，1999，8(13):2557-2566.
5 Bardoni B，Castets M，Huot ME，et al. 82-FIP，a novel FMRP (fragile X mental retardation protein ) interacting protein，shous a cell cycle-dependent intracellular localization. Hum Mol Genet，2003，12(14): 1689-1698.
6 Fields S，Song OK. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature，1989，340:245-246.
