铁、氧自由基与肾小管上皮细胞

关键词： 铁 氧自由基 肾小管上皮细胞 

　　铁，过渡态金属元素之一，外层轨道分布呈3d64s2，化学性质活泼，极易得失电子，产生高反应性氧自由基或铁氧、过铁氧复合物，导致组织损伤。正常情况下，体内的铁以血红素铁或非血红素铁等非反应态存在，但在急、慢性肾脏病变，尤其是伴发蛋白尿的临床和动物模型中可发现小管液及上皮细胞浆内博莱霉素敏感铁即具有催化活性的游离铁显著增加〔1〕，并且可积聚于肾近曲、远曲小管细胞的溶酶体中，偶见于线粒体内。铁的积聚与蛋白尿、肾小管间质病变、脂质过氧化、次全切除肾的肾小球滤过率、残余肾重量等病损程度直接相关〔1，2〕，铁负荷可增加缺血肾的损伤易感性〔3〕；而肾小管上皮细胞是铁介导的氧自由基损伤的主要部位，小管间质病变又是继发性肾单位毁损和慢性进展性肾功能衰竭的主要决定因素〔2〕。因此阐明铁、氧自由基、肾小管上皮细胞间的相互作用机制正受到日益重视。
　　一、铁代谢与肾小管上皮细胞
　　蛋白尿时，尿转铁蛋白排泄增多，转铁蛋白是铁的主要转运形式，相对分子质量为88 000，球形，等电点5.2，与白蛋白(相对分子质量为65 000，pI 4.7)相比，其通过肾小球滤膜更多的是由膜孔的改变而不是受电荷屏障影响〔2〕。尿铁/尿转铁蛋白比例增高提示蛋白尿损害加重，铁的毒性作用与下列因素有关：铁的游离、Fe3+→Fe2+及用以生成·OH的H2O2或其他过氧化体。转铁蛋白结合铁或小管腔内解离铁(亦可来源于血红蛋白、肌红蛋白)可经位于基底膜侧的转铁蛋白受体或刷状缘胞饮作用进入肾小管细胞。一般认为，铁的解离与尿液pH有关，当尿pH接近至6时，有催化活性的游离铁迅速增加，但尿液中铁螯合剂存在的浓度、种类，离子成分，可能存在的还原成分，使尿pH在＜6或＞6时，也能使铁游离〔4〕。尿中游离铁溶解度极低(＜10-6)，当pH＞4时，铁以羟氧化体和磷酸形成不溶性复合物存在，因此小管液中非转铁蛋白结合铁，必须与小分子物质如焦磷酸、ADP或柠檬酸(可能性更大)结合，增加铁的溶解度与反应性。值得注意的是，凡是可缓解肾功能恶化、改善组织学形态的方法，均可同时降低小管液铁，如血管紧张素转换酶抑制剂(如开博通与铁结合可降解O2-〔5〕)、铁缺失、甲状腺切除、限制饮食蛋白、限磷。
　　入胞后的铁大部分以铁蛋白、含铁血黄素形式积聚于溶酶体。胞浆内催化铁的来源途径可能有三：小管腔的重吸收、跨基底膜的摄取、原有细胞内铁储存池的释放。铁释放的因素包括：氧自由基，铁蛋白的动员(Fe3+→Fe2+)，细胞色素P450转换不足，后者可能是缺血再灌注损伤中额外铁、催化铁的重要来源〔6〕。其他来源包括：血红蛋白、线粒体中的细胞色素、过氧化氢酶、某些情况下肾外的血红蛋白、肌红蛋白、脱氢酶4Fc=4S簇等。
　　二、肾小管细胞的铁毒性作用机理
　　近曲小管细胞是铁介导的氧自由基损伤的主要部位　铁对小管细胞的毒性作用取决于铁剂的剂量、接触时间、接触铁的类型、有无转运蛋白等〔7〕。10-4mol/L铁作用于小管细胞即可引起溶酶体铁积聚，各种细胞损伤，包括内质网扩张、线粒体变性、中间纤维增多、自嗜体鞘样结构增加、β1整合素亚基表达下调，损伤修复障碍，肌红蛋白尚有抗细胞增殖作用〔8〕。但目前对于哪个自由基触发和引起损伤、铁源性自由基产生部位和作用途径、导致细胞死亡的关键生化事件等尚有争议。
　　1.氧化损伤学说(oxidant stress)：在缺血、免疫、中毒性(包括肌注甘油后、肌红蛋白、顺铂、庆大霉素)肾病的临床和实验动物模型中，均发现氧自由基作用的直接和间接证据(脂质过氧化产物MDA)。铁通过催化Fenton/Haber-Weiss反应使O2逐步还原，依次形成O2-、H2O2、·OH。·OH的产生具有部位特异性，由于附着于刷状缘胞外膜磷脂的游离铁原位催化而来，且作用于小管腔中＜100 nm的有效范围，去铁胺(DNA，deferoxamine)可阻断其通路，而只有到达该部位的·OH清除剂才能发挥作用；H2O2和O2-则分别可自由穿过胞膜及经离子通道出入细胞。自由基可直接作用于蛋白质、脂质、多糖、DNA，破坏生物大分子；同时自由基可使铁游离为催化活性铁，加重损伤。·OH可氧化含-HS的复合物，-SH的氧化导致细胞内关键酶和转运蛋白如Na+-K+-ATPase的失活，该酶在维持细胞内外离子梯度、细胞转运中有重要作用。脂质过氧化终末产物丙二醛(MDA)、短链烷烃，可破坏细胞膜的脂双层，使生物膜通透性增加，氧化磷酸化中电子传递障碍，溶酶体通透性增加；此外，自由基尚可降解DNA，阻碍损伤后的细胞修复过程，H2O2与Ca2+协同诱导DNA断裂，被认为是氧化损伤的早期事件。
　　目前认为缺血后肾脏病变是由再灌注相的自由基损伤介导，再灌注相时由黄嘌呤氧化酶XO催化的O2还原可能是O2-的主要来源。正常组织中以NAD+为电子受体的胞浆酶黄嘌呤脱氢酶(Type D)在缺血时可向以O2为电子受体的黄嘌呤氧化酶(Type O)转化，转化的发生与细胞内钙离子浓度增加，Type D中的-SH氧化或Ca2+/钙调蛋白依赖的丝氨酸蛋白激酶裂解有关，在肾脏中这种转换约需30分钟，且不可逆；同时，ATP降解产物AMP、腺嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤相应增多，当次黄嘌呤、黄嘌呤氧化时，电子传递至再灌注所供O2，产生O2-。缺血再灌注肾小管上皮内，自由基其他可能来源如下：线粒体内膜电子传递物复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中泛醌-细胞色素b(O2-)，随线粒体呼吸的增加而相应增加；质膜、细胞器内膜中含脂加氧酶和环加氧酶催化的分解代谢(脂肪酸自由基中间产物)；-SH、抗坏血酸还原螯合的Fe3+,Fe2+的自身氧化(O2-)；O2-经自发或催化的歧化作用(H2O2)；内质网和核膜内所含的细胞色素P450、黄素蛋白、近曲小管上皮中大量的过氧化体。
　　·OH一度被认为是介导脂质过氧化的触发因素，但Zager等发现在无机铁作用的小管细胞中苯甲酸、二甲基硫脲、甘露醇对MDA无影响；DFO的细胞保护作用不引起·OH产物的显著下降或与·OH产物下降无关，而谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶则有细胞保护作用，提示可能存在非·OH途径。Zager等第一次指出H2O2是肌红蛋白触发细胞死亡的关键决定因素〔9〕。血红素的氧化损伤研究目前集中于H2O2、线粒体呼吸链、血红素加氧酶(HO)，HO参与介导游离铁的释放，自由基的来源见于线粒体电子传递链的可能较存在酶通路如黄嘌呤氧化酶、花生四烯酸代谢(经环加氧酶、脂加氧酶或细胞色素P450系统)的可能性更大。呼吸链末端部分不仅是自由基形成的关键部位，同时也是肌红蛋白诱导细胞死亡的关键可调控点。此外，线粒体虽然为脂质过氧化提供能源，但不是氧化损伤的对象〔10〕。
　　2.缺血性小管损伤和ATP耗竭：血红素蛋白小管细胞的损伤因素呈多元性，并可相互叠加、相互作用。现在公认的途径包括肾血管收缩、管型形成，坏死残骸(necrotic debris)，内毒素/TNF的激活等，其中缺血损伤与血红素蛋白的肾毒性作用密不可分。缺血时，ATP含量下降，血红素可在容量不足的情况下在近曲小管细胞水平，加强肾缩血管，加重缺血性损伤，该现象可能与胞饮、蛋白重吸收(或某些继发事件)，而不是铁负荷本身有关，而胞饮、重吸收或膜脂质的运输(trafficking)、重建可直接增加质膜对缺血触发损伤的敏感性。血红素内饮直接增加质膜对磷脂酶A2(PLA2)的易损性，质膜脱酰化，乳酸脱氢酶和花生四烯酸释放增加是可能的途径之一，另一途径是否与缩血管作用无关，但由铁介导的细胞能量代谢紊乱有关，有待于进一步证实〔11〕。
　　3.溶酶体失稳定：蛋白尿时，滤过蛋白的过吞饮和溶酶体的超载可引起溶酶体铁的积聚。小管细胞中溶酶体积聚铁的损伤机制目前有两种观点：Harris等在嘌呤霉素肾病中发现溶酶体中铁的积聚是小管间质病变中唯一的、独立的先兆〔12〕，可能与溶酶体内蛋白酶活性增加、溶酶体失稳定，水解酶入胞浆、重吸收蛋白降解不全等有关；部分肾切除模型中小管可见细胞溶酶体酶NAG (N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶)、AP(碱性磷酸酶)活性增加，慢性铁负荷中酶活性增加尤其显著〔1〕。但也有认为溶酶体酶释放是氧化损伤的结果，而不是原因，理由如下：(1)溶酶体内酶的最适pH 3.5～4.0。当释放入中性胞浆时活性受抑；(2)尚未有溶酶体脆性增加的依据，且随着慢性铁负荷加重，脆性反而下降；(3)蛋白尿时，溶酶体膜在电镜下未呈结构缺陷；(4)尿中NAG增多仅见于病变严重时。
　　4.脂质过氧化与细胞毒性作用(cytotoxicity)：细胞毒性作用常用LDH释放率、台盼兰拒染试验、MTT(3-［4，5-二甲基噻唑-l-yl］-2,5溴化二联苯四氮唑)试验等来监测。亚急性铁负荷直接增加缺血鼠肾中脂质过氧化产物〔13〕，去铁胺、血红素氧化酶抑制剂在降低MDA的同时，对铁诱导的细胞死亡具有保护作用，在体外培养的OK细胞系中，选用无血清、10%牛血清、10%牛血清加亚油酸的培养基获得质膜中多不饱和脂肪酸(PUFA)含量各不相同的细胞系，H2O2诱导的细胞损伤程度直接与PUFA含量有关，提示脂质过氧化可直接引起细胞毒作用〔14〕。但有一些试验认为脂质过氧化与细胞毒作用并不一致，GSH作用于血红素负荷的PTS，细胞毒作用下降，脂质过氧化产物反而增多；Fe2+与Fe3+可引起相同程度的脂质过氧化，然而，只有Fe3+引起细胞死亡；呼吸链的阻断可使MDA增多或减少，因此，应谨慎用脂质过氧化来评估细胞毒作用。影响MDA分析的因素很多，如常用肾皮质MDA来代表小管MDA；组织来源的差异；胞浆MDA的干扰；体外培养的正常细胞中可出现MDA等，此外，体内外小管细胞病变进程不一致，体内远落后于体外，脂质过氧化可能是细胞毒作用的条件。
　　5.细胞毒中的介质：(1)Ca2+：细胞内Ca2+浓度升高是多源性小管细胞损伤的共同现象。催化铁引起的氧化应激，破坏Ca稳态，细胞内钙离子浓度上升，游离铁与Ca2+协同，产生H2O2，同时H2O2促使卟啉环中铁释放，形成正反馈〔8〕。钙离子的氧化损伤作用与激活核酸内切酶有关，继之出现DNA片断的断裂，这与细胞凋亡的过程一致；同时，Ca2+依赖的酶活性提高，包括calpain，胞浆内的半胱氨酸蛋白酶；NO合酶；磷脂酶A2的大多数同工酶〔15〕。Calpain和NO均与细胞骨架成分的破坏、细胞极性改变有关，故极有可能在缺血性小管损伤中起重要作用；磷脂酶A2激活可调节游离脂肪酸释放及溶血磷脂的聚积，破坏生物膜，但也有见报道血红素负荷的小管细胞中，Ca2+螯合，不影响脂质过氧化。(2)一氧化氮(NO)：近曲小管细胞内含NO合酶(包括组成型和诱生型)，通过Ca2+、钙调蛋白依赖或独立的途径生成NO，NO可很快与O2结合，生成反应性更强的过氧化含氮化合物(ONOO-)，O2-又可失活NO，超氧化物歧化酶使NO半衰期延长一倍；而NO本身即是一自由基，具有细胞毒作用；同时，NO参与调控铁蛋白mRNA翻译，转铁蛋白受体mRNA的稳定性，介导铁蛋白中催化铁的释放，失活细胞代谢活性所必需的铁硫中心酶；此外，血红蛋白可结合体内重要的扩血管介质NO，加重肾缺血。缺血性急性肾功能衰竭中iNOS是NO的来源，Traylor认为，是脂质A(主要成分(LPS)通过Ca2+激活的NO产生在近曲小管触发氧化损伤〔16〕；在体外的原代小管细胞中，NO的增多或减少可分别加重及缓解缺氧、再氧化损伤，提示NO是缺血再氧化的介质之一；但在肌红蛋白诱导肾毒性的整体实验中，L-Arg、L-NAME未见作用，在缺血再灌注整体大鼠肾中，肾功能不全伴随着NO产物的减少，L-NAME可进一步加重肾功能不全，基础NO与缺血时间有关〔17〕，这提示是否存在血液动力学等影响因素，而不是小管细胞的直接损害。
　　6.与其他蛋白的相互作用：除转铁蛋白外，尿液中的脂蛋白、补体成分等具有小管细胞毒性作用。小管液中残余蛋白可加重铁介导的损伤。新近发现氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)作用于体外培养的LLC-PK1细胞，可诱导增加血红素加氧酶mRNA及蛋白活性，抗氧化剂可阻断此种诱导作用。蛋白尿状态时，进入管腔的LDL，或停留在尿液腔，或经胞饮入胞。LDL的氧化可发生在辅氧化环境的小管腔或小管细胞内，铁加重LDL的毒性作用，依据有：接触铜氧化LDL的细胞内博莱霉素阳性铁增多；DFO防止Ox-LDL的细胞毒及血红素加氧酶的过表达；在破碎红细胞中，血红素促进LDL的氧化〔18〕。
　　三、抗氧化系统与肾小管上皮细胞
　　机体内存在清除自由基的防御体系，包括生育酚、抗坏血酸、β-胡萝卜素、谷胱甘肽、尿酸、胆红素、几种金属酶包括谷胱甘肽过氧化物酶(硒)、过氧化氢酶(铁)、超氧化物歧化酶(铜、锌、镁)，和蛋白质如血浆铜蓝蛋白。有的将金属离子螯合剂、各自由基清除剂归入抗氧化系统。组织损伤的程度取决于自由基生成和抗氧化系统间的平衡关系。一些微量元素的缺乏，加加重自由基损伤。如硒缺乏的小管液中过氧化体增多，硒不足的生长肾中肾间质病变，饮食中硒合并维生素E不足，可产生以蛋白尿、肾小球滤过率下降和间质细胞浸润为特点的肾脏病变。铜、硒缺乏的肾病综合症患者极易受铁源自由基损伤〔2〕。抗氧化剂的肾脏保护作用可能是与去除O2-，保护NO不与O2-反应，取消氧化损伤中的缩血管作用有关。与其他组织相似，氧自由基增多伴随AOE上调，H2O2孵育后的小管上皮细胞过氧化氢酶、GSH过氧化物酶水平上升。抗氧化酶的表达改变多与转录、加工、翻译、翻译后修饰等调节有关。缺血后细胞耐受(cytoresistance)可能与细胞内抗氧化酶保护作用增加有关，但Zager等认为缺血PTS的细胞耐受在缺氧、游离钙负荷、氧化损伤等情况下均存在，故不能以抗氧化酶表达增高或膜磷脂脂肪酸含量改变来解释，是否存在小管细胞膜物理性状改变的可能如细胞极性、流动性、细胞骨架附着，而不是生化成分改变。
　　抗氧化剂常有不止一种的保护机制，可同时兼有抗氧化与辅氧化作用。DFO，不仅可螯合游离铁，减少螯合部位·OH的产生，而且可直接清除·OH，灭活H2O2，或通过次黄嘌呤氧化酶、葡萄糖/葡萄糖氧化酶间接灭活；阻断铁依赖的血红素加氧酶作用，减少肌红蛋白诱导的细胞死亡，抑制近曲小管细胞增殖〔7〕；但DFO本身可引起·OH的显著增加，并促进Fe2+的自身氧化，加重氧化损伤。谷胱甘肽在消除H2O2和脂质过氢氧化体的同时，其代谢产物半胱氨酸的-SH在金属铁催化下产生H2O2，故H2O2的增多不能反应实际的氧自由基作用〔17〕。血红素加氧酶是血红素代谢的限速酶，可催化血红素开环，形成胆红素，释放铁和一氧化碳。诱导HO表达的因素包括H2O2、金属、内毒素、GSH等，其共同通路可能是氧化损伤，HO被认为是肌红蛋白诱导细胞病变的关键决定因素，HO的毒性作用可能是通过游离铁的释放完成的，因为DFO与HO抑制剂的作用相当〔19〕。但在中毒性肾病如顺铂肾病中，顺铂可上调HO mRNA和蛋白水平，HO抑制，血肌酐升高，结构损害加重。HO的保护作用与下列因素有关(1)HO与铁蛋白合成偶联，减少游离铁负荷〔20〕；(2)体外实验证实胆红素可有效清除过氧化自由基，抑制脂质过氧化；(3)改善肾血流动力学；CO (cGMP介导)有扩血管作用，减低血红素，减少NO与血红素的结合；(4)HO可降解细胞色素P450，故HO的诱导与细胞色素P450抑制剂作用相似，可减少催化铁的释放〔5〕。
　　综上所述，在肾小管细胞水平上铁催化的氧自由基作用，是缺血、中毒性肾脏病变中的重要环节，其作用机制涉及氧化损伤、缺血损伤和ATP耗竭、溶酶体失稳定、尿液中其他蛋白的相互作用、抗氧化酶体系不足等，Ca2+负荷、NO是重要的介质。由于体内细胞因子、血液动力学、各物质的相互作用等众多因素的影响，目前对于铁源性自由基产生部位、途径、损伤机制、各自由基损伤作用的主次等尚未明确，阐明肾小管上皮细胞铁毒性的作用机制有助于防治器官移植、血管内溶血、挤压综合症等疾病时出现的肾脏病变，同时改变蛋白尿状态及急、慢性肾脏病变的进程。
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