放线菌素D和VM-26对大鼠胶质瘤细胞增殖的影响的体内实验研究

              作者：武永康，董 伦，刘华伟，申林海

 【摘要】  目的  研究放线菌素D（Actinomycin D，ACTD)和替尼泊苷（Teniposide，VM-26)对大鼠胶质瘤细胞增殖的体内效果。方法  将野生型的C6鼠胶质瘤细胞接种于鼠脑右侧尾状核（对照组10只，空载组10只），并对鼠脑内已形成的C6胶质瘤分别用ACTD及VM-26抗瘤缓释剂瘤区原位注射（治疗组各10只）。观察各组大鼠的一般情况、生存期、肿瘤病和磁共振成像（MRI）动态改变，采用PCNA计数、TUNEL法检测肿瘤细胞增殖活性及凋亡。结果  对照组及空载组大鼠平均生存期为19.3天，ACTD组6只及VM-26组3只大鼠生存期明显延长，存活期超过200天；除因病理检查人为处死各2只外，ACTD组治疗后4周内死亡2只，VM-26组5只。MRI检查对照组大鼠脑内有明显瘤灶，治疗组大鼠脑内瘤灶治疗后明显减少或消失，均与病理学检查结果一致，而且治疗组大鼠C6细胞增殖活性降低，大量细胞凋亡，ACTD较VM-26显著。结论  ACTD可望成为体内局部应用治疗胶质瘤的优选化疗药物。
   
    【关键词】  放线菌素D；替尼泊苷；神经胶质瘤；体内；化疗
    
    
    【Abstract】  Objective  To study the therapeutic effect of ACTD and VM-26 on rat C6 glioma in vivo.Methods  Wild type C6 cells were implanted stereotaxically to the caudate nucleus of right cerebrum of Wistar rats(control and empty loading group，10 rats respectively)，and rats with cerebral tumor foci were treated ACTD and VM-26 mediated by delayed release retarder (treated group，10 rats respectively).The general manifestation，survival time，MRI features，histopathological change，proliferation activity and apoptosis of the glioma in each group of rats were observed.Results  The mean survival time of control animals was 19.3 days.Two ACTD or VM-26 treated rats were killed on day 28 and 58 after implantation for histopathological examination.The surviving time of the 9 remaining rats(6 ACTD and 3 VM-26 treated rats)was over 200 days.MRI demonstrated a distinct cerebral tumor in control rats，but the tumor foci were disappeared almost completely in the treated rats.The cerebral glioma of rats after the treatment with ACTD showed decrease in proliferation activity and apoptosis，significantly decrease than the treatment with VM-26.Conclusion  The results of ACTD in treatment of rat C6 glioma is encouraging.It can be used as the chemotherapy for human malignant glioma.
   
    【Key words】  ACTD；VM-26；glioma；in vivo；chemotherapy
   
    我们以往的研究结果表明，放线菌素D(Actinomycin D，ACTD)可显著抑制C6鼠胶质瘤细胞恶性增殖诱导细胞凋亡，在4个不同的浓度对比中ACTD的抑瘤作用均强于替尼泊苷(Teniposide，VM-26)，凋亡率在大剂量ACTD时的作用明显优于VM-26［1］。为进一步明确二者对恶性胶质瘤化疗疗效，我们研究了C6细胞接种于鼠脑的致瘤性以及对鼠脑内已形成瘤灶的C6胶质瘤应用ACTD及VM-26的抗瘤缓释剂瘤区原位治疗的疗效，观察大鼠的一般情况、生存期、肿瘤体积变化以及肿瘤病理组织学与细胞生物学特征变化。
   
    1  材料与方法
   
    1.1  实验材料  C6鼠胶质瘤细胞系由院动物所提供。细胞培养基：DMEM （Dulbecco modified eagle medium Gibco，USA)，小牛血清（Hyclone，USA)。主要生化试剂：将消毒后的医用明胶10g加入注射用水50ml，分别加入ACTD 0.1g及VM-26 0.5mg，搅拌成半流状，制成抗瘤缓释剂。原位细胞凋亡检测试剂盒（Roche，Germany)，ABC免疫组化试剂盒及抗体（北京中山及其代理的Santa Cruz公司）。主要仪器：江湾Ⅰ型脑立体定向仪（第二军医大学生产），磁共振仪（Advantage 1.5 Tesla GE Medical Systems，GE Corporation，USA)。实验动物：二级雄性SD大鼠，体重200～300g，共40只，由北京生物制品检定所繁育场提供，其特征已经鉴定。
   
    1.2  实验方法
   
    1.2.1  C6鼠脑胶质瘤模型的建立［1］  C6鼠胶质瘤细胞于含10%小牛血清的DMEM培养液中单层培养。接种细胞量为1.0×106/(10μl·只)。大鼠经10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于江湾Ⅰ型脑立体定向仪上，手术暴露颅骨标志，在前囟位置，矢状缝右侧3.0～3.5mm处用牙钻钻孔，孔径1.2mm，用微量注射器垂直穿刺右尾状核，将细胞悬液缓慢注入。
   
    1.2.2  实验动物分组及组织标本采集  颅内实验运动分为4组，每组各10只SD大鼠：（1）对照组：接种野生型C6鼠胶质瘤细胞；（2）空载缓释剂组：接种野生型C6鼠胶质瘤细胞后瘤体多点注射半流状医用明胶；（3）ACTD治疗组：治疗组C6鼠胶质瘤细胞种植后第5天，MRI证实有肿瘤形成时，分别于第6、28天按上述方法麻醉、固定动物；同时将制备好的ACTD抗瘤缓释剂原位多点注入瘤体；（4）VM-26治疗组：治疗组C6鼠胶质瘤细胞种植后第5天，MRI证实有肿瘤形成时，分别于第6天按上述方法麻醉、固定动物；同时将制备好的VM-26抗瘤缓释剂载体原位多点注射入瘤体。接种后28、58天各处死1只，瘤标本做常规HE染色并检测凋亡；其余8只长期观察生存期。
   
    各组实验动物在其死亡或人为处死后取出脑组织，将肿瘤标本于10%福尔马林溶液中固定，常规石蜡包埋后冠状切片，行大体标本观察、常规HE染色；另进行PCNA免疫组化染色。另一部分标本用OCT包埋液氮速冻-70℃保存冰冻切片，行原位细胞凋亡的检测。
   
    1.2.3  MRI成像及检测方法［2］  用GE公司1.5T Signa MR机成像，冠状面和矢状面T1WI平扫及增强扫描。根据动物模型对照组生存期，本实验的治疗组和空载组各10只大鼠于种植后5天进行全部检测，了解成瘤情况，以便治疗。大鼠种植后1周随机选择4只动物进行检测。以后连续检测各组大鼠的肿瘤生长变化，具体时间为2周、4周、8周、12周。每次检测，除至少选择3只种植后5天或1周已进行检测的动物连续监测外，其他动物则每次选择1～2只轮换进行检测，了解动物成瘤率。
   
    肿瘤体积：在实验设计要求的时间点，根据强化影像在冠状扫描最大肿瘤平面测量肿瘤最大长径（L）及宽径（W），在矢状扫描最大肿瘤平面测量高径（H），代入公式：V=（4/3×π× L×Ｗ×Ｈ)×1/8。
   
    1.2.4  组织标本的常规HE染色及细胞凋亡的检测  详见［1～3］，方法从略。
   
    2  结果
   
    2.1  大鼠一般情况与生存期观察  对照组及空载组：接种C6细胞1周后，大鼠觅食饮水活动明显减少，体重下降，继而出现进行性左侧偏瘫，并均于2～3周内死亡。8只大鼠平均生存期为（19.3±4.9)天。
   
    2.2  治疗组  最初2～3周内大鼠一般情况类似对照组，处于濒死状态。ACTD组10只大鼠中3只分别于接种第16、21、37天死亡；另6只未死亡的大鼠自第4周起觅食饮水活动逐渐恢复正常，体重增加，其中2只分别于接种后第28、58天处死，3只于第200天处死行病理学检查。VM-26治疗组10只大鼠中5只分别于接种后第16、18、22、36、41天死亡；另5只未死亡的大鼠自第4周起觅食饮水活动逐渐恢复正常，体重增加，其中2只分别于接种后第28、58天处死，3只第200天处死行病理学检查。

    
    2.3  MRI影像学及相应组织病变化  对4组大鼠定期检查MRI，并于检查后随机处死，观察相应病理变化。
   
    2.3.1  对照组  接种C6细胞1周后瘤区表现为淡长T1长T2信号，轻度均匀或不均匀强化，中线结构轻度移位，病灶体积分别为155、150、186、172mm3。2周后瘤灶为长T1长T2信号，均匀强化或环状强化，中线结构明显移位，其中3只脑室扩大，瘤灶体积为410、740、546、630、590mm3。病理检查可见C6细胞生长活跃，瘤内有囊变、坏死，侧室脉络丛、室管膜下及蛛网膜下腔可见少量肿瘤细胞。空载组结果与对照组相似。
   
    2.3.2  ACTD组  接种后1周及2周时观察的结果同对照组。接种后4周及8周检查发现原强化瘤灶逐渐缩小，中线轻度左移，脑室扩大。接种12周及28周时复查，瘤灶消失，中线结构无移位。第200天病理检查脑实质内均未见肿瘤细胞，侧室脉络丛，室管膜下及蛛网膜下腔可见少量非增殖性C6细胞（见图1）。

A：接种成瘤后1周；B：接种成瘤后2周；C：接种成瘤后4周；D：接种成瘤后12周

图1  ACTD治疗组大鼠脑部MRI冠状面扫描影像

    2.3.3  VM-26治疗组  结果与ACTD治疗组相似，但肿瘤瘤灶缩小程度不如ACTD组。且28周时2只仍有残存瘤灶。
   
    2.4  肿瘤细胞增殖活性测定  对照组及空载组肿瘤细胞PCNA平均计数为8.92±5.29。ACTD治疗组中，3只于接种后第2～3周死亡，其肿瘤组织PCNA计数分别为4.05、3.91、5.45；而于接种后第28、58天处死者其肿瘤组织PCNA计数分别为2.45及1.83。VM-26治疗组中，5只于接种后第2～3周死亡，其肿瘤组织PCNA计数分别为5.05、3.21、6.20；而于接种后第28、58天处死者其肿瘤组织PCNA计数分别为3.55及3.42。
   
    2.5  细胞凋亡检测  对照组及ACTD和VM-26治疗组中治疗无效死亡的荷瘤鼠C6肿瘤中偶见凋亡细胞；空载组可见少量凋亡肿瘤细胞；而ACTD及VM-26治疗组于接种后第28天及58天处死的大鼠C6肿瘤中可见大量凋亡细胞，前者要多于后者。
   
    3  讨论
   
    在大鼠脑内接种同种胶质瘤细胞系建立胶质瘤动物模型是检验各种治疗方法的重要手段［2～4］。我们用MR成像动态观察C6鼠胶质瘤模型及治疗后的变化，易于观察胶质瘤颅内生长，动态观察瘤灶的变化，有助于探讨其生长和治疗后的改变［4、5］。
   
    VM-26为表鬼臼毒人工半合成衍生物，为周期特异性细胞毒药物，作用于细胞周期S2后期和G2期，通过阻止细胞进入有丝分裂期而起作用，又通过抑制DNA拓扑异构酶Ⅱ引起DNA单链和双链断裂，产生细胞毒作用。其分子量小，脂溶性较高，易通过血脑屏障，适用于脑瘤的治疗，凋亡。但体内实验表明药物单独使用有效率不高，且加大剂量会引起严重的毒副反应，主要为骨髓抑制，主要表现为白细胞、血小板减少。而ACTD是酯酞类抗肿瘤抗生素，抗肿瘤的机制与VM-26不同，其通过活化胶质瘤细胞半胱肽酶-3而有效地诱导凋亡，发挥细胞杀灭作用，临床上常用于治疗恶性葡萄胎、子宫绒毛膜上皮癌、黑色素瘤等，疗效确切，毒副反应相对较轻。由于其不易透过血脑屏障，因而以前通常很少用于颅内肿瘤的治疗。最近我们在C6胶质瘤细胞的体外试验中发现，在不同摩尔浓度梯度对比中，各级别的ACTD抑制肿瘤增值作用显著优于VM-26［1］。Naritan等最近用体外肿瘤抑制试验也证明其对胶质母细胞瘤具有非常强的肿瘤抑制作用［6］。而应用ACTD缓释剂可以使其在瘤体局部直接作用于肿瘤细胞，最大限度地发挥了其良好的抗肿瘤疗效，增强了药物的局部浓度，降低了毒副反应，克服了血脑屏障的阻滞作用。
   
    我们的试验结果发现，ACTD治疗组在治疗后1周病灶仍继续增大，与对照组差异无显著性。但治疗后2周病灶缩小，其体积明显小于同期对照组，强化变浅变淡。3～4周时这种差异更加明显，中线结构移位亦减轻。12周时病灶变为含脑脊液信号的囊腔，脑室仍扩大，病理检查上在种植部位已见不到肿瘤细胞，但室管膜下仍可发现。对照组均4周内全部死亡，而ACTD治疗组除处死的2只外，第12周时仍有6只存活良好，而VM-26则仅存活3只。本研究表明，瘤内注射ACTD缓释剂对C6鼠胶质瘤的抑制作用较VM-26强。其肿瘤的生长较VM-26治疗组缓慢，存活期亦延长。用抗PCNA的单抗可评估肿瘤细胞的增殖活性，该方法是目前运用最多的反映细胞增殖的指标之一［5］。本研究表明，ACTD与VM-26治疗后，细胞核内的PCNA明显减少，反映了二者作用均可降低细胞的增殖能力，而前者要比后者更为显著，这在细胞水平上更加明确地验证了MRI检查结果。
   
    本课题是对体外试验的进一步深化和验证，并为最终ACTD缓释剂的临床应用提供了可靠实验依据。

【】

    1  武永康，董伦，张恒柱.放线菌素D和VM-26对大鼠胶质瘤细胞增殖的影响的实验研究.中华新医学，2005，6(7)：755-777.    
    2  Schlegel J，Piontek G，Kuhne C，et al.Molecular genetic characterisation of intracerebrally transplanted brain tumours.Exp Toxicol Pathol，1999，51(1)：41-45.    
    3  Zhang Y，Cui J，Liu X，et al.MR imaging in rat glioma model and gene therapy using EGFR antisence RNA.Chin Med J(Eng1)，1998，111(11)：993-997.    
    4  刘旭文，浦佩玉，王广秀.表皮生长因子受体反义cDNA对C6鼠脑胶质瘤体内治疗的研究.中华肿瘤杂志，1998，20(6)：211-213.    
    5  张云亭，崔建岭，刘旭文.C6鼠胶质瘤模型及表皮生长因子受体反义RNA治疗的MRI动态观察.中华放射学杂志，1998，32(4)：124-127.    
    6  Narita Y，Asai A，Kuchino Y，et al.Actinomycin D and staurosporine，potent apoptosis inducers in vitro，are potentially effective chemotherapeutic agents against glioblastoma multiforme.Cancer Chemother Pharmacol，2000，45：149-156.