原位肝移植中移植肝早期功能的评价

     作者:杨卫平，邱伟华，谢俊杰，陈 皓，施敏敏，申 川，沈柏用，彭承宏，李宏为 

【摘要】  目的  通过测定原位肝移植中一些血清学指标来评价肝移植术后早期移植肝的功能状况。方法  随机选取瑞金肝移植中心原位肝移植患者20例。分别在麻醉开始后（S）、无肝期开始即刻（A1）、无肝期结束前即刻（A2）、门静脉血流开放即刻（R0）、门静脉血流开放60min（R1）、门静脉血流开放3h（R3）、门静脉血流开放6h（R6）、门静脉血流开放12h（R12）、门静脉血流开放24h（R24）时间点抽取外周血，测定血清ALT、AST、LDH、GMP-140、vWF和HA。结果  ALT、LDH在再灌注后即刻（R0）、AST在R6即达到峰值（P<0.05），以后逐渐下降，但仍维持较高水平。LDH与ALT呈高度正相关（R＝0.948，P<0.001），LDH与AST呈中度正相关（R＝0.646，P<0.001）。GMP-140再灌注后开始升高，R3、R6、R12点达到峰值（P<0.001），以后逐渐下降，但仍维持高水平。血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）在再灌注后R6、R12、R24点高于正常。HA在再灌注后均高于正常。结论  AST和ALT仍然是原位肝移植术后早期反映移植肝功能状况的可靠指标；LDH与ALT及AST存在良好相关性；GMP-140、vWF和HA的升高反映了肝窦内皮细胞（SEC)的损伤程度，但能否准确反映早期移植肝功能状况则有待进一步证实。
   
    【关键词】  原位肝移植；缺血－再灌注损伤
   
    Early assessment of graft function in orthotopic liver transplantation
    
   【Abstract】  Objective  The aim of this study is to estimate the status of hepatic graft by measurement the levels of some serum index in orthotopic liver transplantation.Methods  20 recipients receiving orthotopic liver transplantation has been selected randomly in the transplantation center of Ruijin Hospital.The levels of serum ALT，AST，LDH，GMP-140，vWF and HA were determined at the following time points:the start of the operation (S)，the commencement of anhepatic phase (A1)，the end of anhepatic phase (A2)，instant (R0)，60 minutes (R1)，3 hours (R3)，6 hours (R6)，12 hours (R12) and 24 hours (R24) after reperfusion of portal vein.Results  The level of ALT and LDH arrived the peak value at the time point of R0.The level of AST arrived the peak value at the time point of R6，and the level of LDH was correlated notably with the level of ALT and AST.The level of GMP-140 reached the peak value at the time point of R3，R6 and R12 (P<0.001) and higher than normal level.The level of vWF was higher than normal at the time point of R6，R12 and R24.The level of HA was higher than normal at every time point after reperfusion.Conclusion  The levels of AST and ALT are still reliable parameters for the assessment of initial hepatic graft function;the level of LDH has good correlation with the levels of ALT and AST;the elevation of the levels of GMP-140，vWF and HA reflects the damage of sino-endothelial cell (SEC)，but whether they could reflect initial graft function or not is still need to be certified.
   
    【Key words】  orthotopic liver transplantation;ischemia and reperfusion injury
   
    原位肝移植术后早期确定移植肝功能的状态非常重要。肝脏的冷保存-再灌注损伤是造成移植肝早期肝功能不良的重要因素。本研究通过检测20例原位肝移植手术前后一些血清学指标来评价肝移植术后早期移植肝的功能状况。
   
    1  资料与方法
   
    1.1  一般资料  随机选取瑞金医院肝移植中心在2003年9月～2004年4月所施行的原位肝移植患者共20例。其中男18例、女2例，年龄35～65岁，平均（50.05±7.65）岁。受体原发病：乙肝后肝硬化10例（50%），乙肝后肝硬化伴肝癌7例（35%），急性重症肝炎2例（10%），多囊肝1例（5%）。术前受体肝功能按Child-Pugh分级评定：A级4例（20%），B级1例（5%），C级15例（75%）。
   
    所有供体肝脏的获取均采用4℃UW液经腹主动脉、门静脉双灌注，肝脏取下后4℃ UW液保存，冷缺血末期常规做肝脏快速冰冻切片病理检查。供肝脂肪变性按下列标准分级［1］：无大泡型脂肪变性、轻度大泡型脂肪变性（<30%）、中度大泡型脂肪变性（30%～60%）、重度大泡型脂肪变性（>60%）。原位肝移植手术方式采用经典原位肝移植或背驮式原位肝移植，术中均不采用体外静脉-静脉转流。复温缺血时间（rewarm ischemic time，RWIT）为门静脉阻断、供肝置入体内至门静脉开放时间。
   
    原位肝移植后采用的免疫抑制方案采用激素加FK506二联用药。
   
    1.2  标本采集时间  肝移植期间在下列时间点抽取外周血液标本：S：麻醉开始后；A1：无肝期开始即刻；A2：无肝期结束前即刻；R0：门静脉血流开放即刻；R1：门静脉血流开放60min；R3：门静脉血流开放3h；R6：门静脉血流开放6h；R12：门静脉血流开放12h；R24：门静脉血流开放24h。
   
    1.3  方法  每个时间点各抽取外周血5ml于普管，在30min内进行低温离心（BECKMAN AllegraTM 6R Centrifuge），4℃、3000转/min、10~15min，取上清液于－80℃保存。酶标仪U Quant（BIO-TEK INSTRUMENT，Inc）及配套软件KCjunior V1.31.5（BIO-TEK Autoreader Control）测定ALT、AST和LDH。IL-6：ELISA，采用酶联免疫吸附双抗体夹心法原理定量测定（由BioSource公司提供）。GMP-140：ELISA，采用酶联免疫吸附双抗体夹心法原理定量测定（由上海太阳生物技术公司提供）。vWF：ELISA，采用酶联免疫吸附双抗体夹心法原理定量测定（由上海太阳生物技术公司提供）。HA：竞争ELISA定量检测（由上海海研医学生物技术有限公司提供）。
   
    1.4  统计学方法  数据以均数±标准差（x±s）表示。临床资料中计量资料的比较采用t检验，表示为（x±s）；计数资料的统计方法采用Fisher确切概率法，用Num（%）表示；对于实验结果各指标每个时间点之间变化差异采用两因素方差分析，组间比较采用Bonferroni法。对于各实验结果两组间各时间点均值比较采用团体t检验。两指标之间相关性分析采用Pearson相关分析。P值小于0.05为差异有显著性。统计软件采用SPSS 12.0（SPSS Inc.）软件进行数据分析。
   
    2  结果
   
    2.1  临床结果  20例原位肝移植中背驮式13例（65%），经典式7例（35%）。供体心脏停搏时间（non-heart-beating time，NHBT）平均（1.95±1.32）min，冷却血时间（cold ischemic time，CIT）平均（11.07±1.94）h，RWIT平均（45.95±8.65）min。
   
    供肝冷保存末期、移植前肝活检病理显示4例有轻度大泡型脂肪变性。
   
    2.2  检测指标结果
   
    2.2.1  丙氨酸氨基转移酶（ALT）  ALT在再灌注后（R0）即刻即达到峰值，以后逐渐下降，但各点仍在较高水平，与R0点比较差异无显著性（P>0.05）（见图1）。与S点比较：*P＜0.001

            图1  ALT变化   与S点比较：*P＜0.001；**P＜0.05
   
2.2.2  天冬氨酸氨基转移酶（AST）  AST在再灌注开始升高，6h后达到峰值，以后逐渐下降，但在R24点仍在较高水平（见图2）。再灌注后各时间点与R6比较：?P＜0.05；△P＜0.001

                           图2  AST变化
   
    2.2.3  乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）  LDH再灌注后（R0）即达到峰值，后逐步下降，但R3～R24仍维持较高水平（见图3）。与S点比较：*P＜0.001；再灌注后各时间点与R0比较：?P＜0.05；△P＜0.001 

                            图3  LDH变化
   
    2.2.4  LDH与ALT及AST相关性分析  LDH与ALT呈高度正相关（R=0.948，P<0.001），LDH与AST呈中度正相关（R=0.646，P=0.004）。
   
    2.2.5  血小板颗粒膜蛋白（GMP-140）  GMP-140自再灌注后开始升高，R3、R6、R12点达到峰值（P<0.001），至R24已显著下降（见图4）。R3、R6、R12点值均高于正常值（正常值9.4～20.8ng/ml）。与S点比较：*P＜0.001 

                           图4  GMP-140变化
   
    2.2.6  GMP-140与AST及ALT相关性分析  GMP-140水平与AST呈中度正相关（R＝0.670，P＝0.002）。而与ALT水平缺乏相关性（P＝0.058）。

   
2.2.7  血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）  vWF在各时间点间均无显著变化（P>0.05），但再灌注后R6、R12、R24点高于正常值（60%～150%），见图5。 

                             图5  vWF变化
   
    2.2.8  vWF与ALT及AST相关性分析  vWF值与ALT及AST均呈中度负相关（ALT:R=-0.627，P=0.005；AST:R=-0.483，P=0.042）。
   
    2.2.9  透明质酸（hyaluronic acid，HA）  透明质酸（HA）在术前最高，再灌注后各时间点之间差异无显著性（P>0.05），但均高于正常值（<160ng/ml）（见图6）。 与S点比较：*P＜0.001

                         图6  HA变化
   
    2.2.10  HA与ALT及AST相关性分析  HA水平与ALT呈中度负相关（R=-0.578，P=0.012）。而与AST水平缺乏相关性（P=0.055）。
   
    3  讨论
   
    国内外许多研究报道，通过检测下列指标来反映移植肝的功能状况：术后受者酸中毒情况、受者凝血功能情况、血清胆红素水平、HA水平、动脉血酮体比等。本研究检测了原位肝移植手术前后血清ALT、AST、LDH、GMP-140、vWF、HA等指标以评价肝移植术后早期移植肝的功能状况。
   
    血清ALT和AST是通常评价移植肝获取、冷保存、再灌注过程损伤情况的最常用指标［2］。由于肝脏内转氨酶的含量为血中含量的100倍，只要1%的肝细胞坏死，便足以使血清中酶活性增加1倍。因此血清中ALT、AST的水平是肝细胞损伤的敏感
   
    指标，且在再灌注后短时间内即可在体循环中测定，因此许多学者将ALT、AST的升高作为诊断肝移植后移植肝损伤的依据。Nanashima［2］等研究表明，再灌注后5min内ALT和AST水平在IPGF病人中显著升高且持续时间长。在本研究中，AST在再灌注后1h即显著升高，6h达到高峰；ALT值在再灌注后即达到峰值。AST和ALT在再灌注早期即已显著升高，可及时反映出肝实质细胞受到的损伤程度，因此，ALT及AST是反映肝实质细胞损害的敏感指标，术中再灌注后早期检测ALT和AST水平可作为预测、评估移植肝功能的可靠指标。在本研究中，LDH与ALT及AST存在良好相关性，其水平在再灌注后迅速达到峰值。因此，LDH与ALT及AST水平的一同检测，对于判定及预测移植肝功能有相当重要的价值。
   
    GMP-140也称为P选择素（P-selectin），GMP-140由血管内皮细胞合成，贮存于血小板的α颗粒及内皮细胞的Weibel-Palade小体，是与Weibel-Palade小体相关联的黏附蛋白，主要介导血小板或内皮细胞与中性粒细胞的黏附，为参与缺血再灌注损伤中中性粒细胞与血管内皮细胞黏附过程的重要分子［3］。肝窦内皮细胞（SEC）在再灌注后早期即被激活，表现为Weibel-Palade小体与胞膜融合增加，并使GMP-140表达增加，介导白细胞黏附到SEC［1］。Basile［4］研究认为，缺血再灌注损伤是包含细胞因子释放、Kupffer细胞及SEC激活的炎症过程。在保存24h的移植物中，GMP-140水平在1h内显著升高且在移植后24h降至基线。而在保存48h的移植物中再灌注后GMP-140呈低表达。因此，其认为GMP-140水平可用于区分“可存活”肝脏和“不可存活”肝脏。在本研究中，GMP-140水平在再灌注3h后显著升高，其与AST水平呈正相关，本研究中GMP-140水平在再灌注后3h起显著升高并维持较高的水平，在一定程度上反映了SEC的损伤。但由于本研究中平均冷保存时间均未超过12h，因此GMP-140能否反映肝移植术后早期肝功能情况仍有待进一步研究。
   
    vWF是一种血浆糖蛋白多聚体，由血管内皮细胞、巨核细胞在内质网合成，储存于血管内皮细胞的Weibel-Palade小体和血小板的α颗粒中。因此，vWF水平和功能反映了SEC的激活、损伤［5］。冷保存－再灌注导致SEC激活和损伤，这些变化的程度影响早期的移植肝功能。在再灌注后，激活的SEC促进黏附分子的表达增加（包括vWF），并释放入周围循环。Basile［6］分析了35例原位肝移植，发现在早期移植肝脏功能良好的患者，vWF在门静脉中水平显著高于下腔静脉中水平。在本研究中，vWF水平在再灌注后仍保持较高水平，由于平均冷保存时间均未超过12h，因此vWF水平与SEC损伤之间的关系仍有待进一步研究。在本研究中尚不能说明vWF水平与术后早期移植肝功能存在必然联系。
   
    HA是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖缩合而成的高分子酸性黏多糖，是结缔组织的主要成分，在肝脏内由嗜脂细胞产生。血液中90%的HA通过受体摄入到SEC内分解。Schon［7］在1994年便提出，人们评价肝功能主要集中在肝细胞的功能情况，而往往轻视了非实质细胞如内皮细胞功能的测定。而血清HA水平则是内皮细胞功能的反映。Schon研究发现，HA水平在再灌注6h内显著下降。对肝移植病人HA水平的测定将对肝脏内皮细胞的功能状态提供极有价值的信息。他还认为HA与转氨酶的释放并不完全平行。Shimizu［8］通过小鼠的缺血再灌注损伤模型研究发现，再灌注后2h，由HA反映的内皮细胞功能在移植肝功能不良组中已表现出显著恶化，HA值显著升高；而ALT在再灌注4h后才显著升高。他认为在再灌注早期，主要为SEC损伤。Williams［9］等研究发现，血清HA作为SEC功能的标志物，在SEC受到损伤时，其水平显著升高。在内皮细胞破坏后2天达到峰值，后逐渐下降。Suehiro［10］研究发现，SEC被认为是冷保存再灌注损伤发生的首要对象。HA和内皮缩血管肽-1（Endothelin-1，ET）是内皮细胞完整性的标志。Suehiro对85例成人原位肝移植进行研究，发现严重肝病患者术前HA和ET水平高于一般肝病患者。再灌注后60min和120min，早期移植物功能不良患者HA摄取显著低于移植物功能良好者。因此认为围手术期HA摄取测定可作为早期移植物功能的评估标准。Rao［5］分析了102例原位肝移植，对HA水平、早期移植物功能和最终移植物结果的关系进行研究分析。由于微血管内皮细胞对HA的摄取显著高于其产出，因此移植肝功能不良者，内皮细胞的损伤致使HA摄取下降而使血液HA水平升高。他认为在临床原位肝移植中，HA水平可作为评估移植肝功能的可靠检验。在本次研究中，再灌注后HA值要高于正常值，这与众多报道结果相符。HA水平与术后早期移植肝功能的关系有待进一步扩大样本进行研究。
   
    综上所述，本研究结果提示：AST和ALT仍然是原位肝移植术后早期反映移植肝功能状况的可靠指标；LDH与ALT及AST存在良好相关性，可在一定程度上反映出术后早期移植肝功能情况；GMP-140、vWF和HA的升高反映了SEC的损伤程度，但能否准确反映早期移植肝功能状况则有待进一步证实。

【参考文献】

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