人源M2三联体靶抗原BPO-E2融合蛋白的克隆表达与鉴定

     作者:周晔，姚定康，陈燕，蒋天舒，蒋廷旺，吴传勇，陈波，邓安梅

［摘要］  目的  用基因工程的方法克隆表达抗线粒体抗体二亚型（AMA-M2）的3个靶抗原侧链二氧酸脱氢酶复合体E2（BCOADC-E2）、丙酮酸脱氢酶复合体E2（PDC-E2）、2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2（OGDC-E2）及其连接形成的三联体BPO-E2融合蛋白，以用于人原发性胆汁性肝硬化（PBC）的早期发现和临床诊断。方法  针对BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2的cDNA序列设计引物，从正常人的淋巴细胞中提取RNA，通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段，经测定序列验证后插入表达载体pET28a（+），构建重组表达载体pET28a(+）-BCOADC-E2、pET28a(+)-PDC-E2、pET28a(+)-OGDC-E2、pET28a(+)-BPO-E2，转化大肠杆菌BL21（DE3）后诱导表达蛋白质。表达蛋白经SDS-PAGE、Western-blot等鉴定。结果  经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明，成功地构建了4种重组质粒。IPTG诱导表达后，获得4种融合蛋白。经免疫学鉴定，重组抗原片段具有AMA-M2的免疫原性。结论  重组表达的融合蛋白将有利于原发性胆汁性肝硬化（PBC）的实验室诊断。
   
    ［关键词］  肝硬化，胆汁性；自身抗原；重组融合蛋白质类
   
    cDNA cloning and expression of autoantigen BPO-E2
    
    ［Abstract］  Objective  To express BPO?E2 recombinant fusion protein in E.coli.in order to be used in early diagnosis of PBC.Methods  The cDNA encoding BCOADC-E2，PDC-E2 and OGDC-E2 were obtained by RT-PCR，confirmed by DNA sequencing，subcloned unidirectionally into the bacterial expression plasmid pET28a(+) and then transformed into E.coli.，BL21(DE3) to express the recombinant fusion protein induced by IPTG.Results  The recombinant fusion protein exhibited the antigenicity of AMA-M2 by western blotting.Conclusion  The BPO-E2 recombinant fusion protein could be used for diagnosis of PBC.
   
    ［Key words］  liver cirrhosis，biliary;autoantigens;recombinant fusion proteins
   
    原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC)是一种以肝内中、小胆管的非化脓性进行性炎性损伤为特征，最终导致肝硬化和肝衰竭的典型自身免疫性疾病（AID）［1，2］。在PBC患者体内可检出多种自身抗体，如抗核抗体（ANA）、抗线粒体抗体（AMA）、抗平滑肌抗体（SMA）、抗肝肾微粒体抗体（LKM）等，其中最主要的抗体是AMA［3，4］。AMA分为M1～M9共9个亚型，而只有M2为PBC特异抗体。AMA-M2抗体对PBC检测的敏感性达93%以上，特异性几乎达100%［5］。M2抗体的靶抗原为线粒体上的2-氧酸脱氢酶复合体（2-OADC）的一些组分：丙酮酸脱氢酶复合体E2（PDC-E2）、2-氧酸脱氢酶复合体E2（BCOADC-E2）、2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2（OGDC-E2）等。笔者用基因工程的方法表达BPO-E2融合蛋白，为PBC的早期发现和特异性诊断提供有效手段。
   
    1  资料与方法
   
    1.1  一般资料
   
    1.1.1  血清标本  22例血清来源于我院住院病人，经德国Euroimmun公司免疫印迹试剂盒测定，M2抗体为阳性。
   
    1.1.2  主要试剂  反转录酶、PCR扩增试剂盒、RNA提取试剂盒为QIAGEN公司产品。各种限制性内切酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司。pET-28a（+）质粒及大肠杆菌BL21（DE3）购自Novagen公司。间接免疫荧光法测定AMA试剂盒购自Euroinmun公司。
   
    1.1.3  引物  参照人BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2全序列，设计引物。BCOADC-E2正向引物：5-ATCGCATCCGCACAGGTTGTTCAGTTCAT-3；BCOADC-E2反向引物：5-TAATTTTTGCA TGCACGGCGAACTGCAGGAGT-3。PDC-E2正向引物：5-TTCGCCGTGCAAAAATTAT ACACTGGTATCCTG -3; PDC-E2反向引物：5-ACAGCTGTGAGCTCTAAATCTGTTACTTCGGTTG-3。OGDC-E2正向引物：5-CAGATT TAGAGCTCACAGCTGTATGCAAGGATGA-3；OGDC-E2反向引物：5-?ATCGCGTCGACAGGAGCAGCACCATG TTTCC-3。
   
    1.2  方法
   
    1.2.1  基因克隆操作  用淋巴细胞分离液从健康人外周血中分离单个核细胞，得到的白细胞抽提RNA，反转录得到cDNA。pET-28a（+）质粒分别用BamH1和Sph1、Sph1和Sac1、Sac1和Sal1、BamH1和Sal1双酶切后，经T4DNA连接酶的作用将BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2、BPO-E2的cDNA对应定向插入其中。送上海生工生物工程技术公司测定序列进行鉴定。PCR扩增反应条件为94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环后再进行72℃延伸5min。
   
    1.2.2  重组质粒的转化和鉴定  将重组质粒用氯化钙转化法导入宿主菌BL21（DE3），加入LB培养液37℃震荡培养45min后涂布于LB平板上（含终浓度100μg/ml卡那霉素）培养过夜。抽提质粒，用1%琼脂糖凝胶电泳观察重组质粒和酶切后的产物，见图1。

注:Lane 1：pET28a(+)质粒;
Lane 2：BamH1和Sph1酶切后的pET28a(+)-BCOADC-E2质粒;
Lane 3：Sph1和Sac1酶切后的pET28a(+)-PDC-E2质粒;
Lane 4：Sac1和Sal1酶切后的pET28a(+)-OGDC-E2质粒;
Lane 5：BamH1和Sal1酶切后的pET28a(+)-BPO-E2质粒
M.  DNA  Marker DL2000
图1  重组质粒双酶切鉴定电泳图

    1.2.3  重组融合蛋白的收集和纯化  次日挑取转化平皿上的菌落，接种于含卡那霉素的LB培养液中，37℃摇床培养扩增至A600为0.4左右，加入终浓度为0.1mg/ml的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG），诱导表达4h，4℃离心收集菌液。将菌液反复冻融4次，经超声破碎仪以300W，15s，破碎4次，以上操作在冰浴中进行。然后在4℃，10000g离心15min，收集沉淀，以含0.5%TritonX-100，10mmol/L EDTA的缓冲液洗涤后，用100μl裂解缓冲液（含0.1mmol/L PMSF，8mol/L尿素，10mmol/L DTT)溶解包涵体，室温放置1h。再加入900μl氧化还原缓冲液，最后离心取上清液。将上清液流经PBS平衡后的GST亲合层析柱，经PBS 20ml洗涤后，用5mmol/L还原型谷胱甘肽溶液洗脱，收集洗脱液进行15%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺胶电泳（SDS-PAGE）分析。

    
    1.2.4  重组蛋白抗原性的鉴定  BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2、BPO-E2重组蛋白经SDS-PAGE电泳后进行转印，200mA，40V，2h。将转印后的NC膜剪成条带，用含5%BSA的PBS封闭1h，与1∶1000稀释的人M2阳性血清为一抗反应2h，充分洗涤后与1∶1000稀释的HRP标记的免抗人IgG二抗反应2h，再次洗涤后加入3，3-二氨联苯胺底物及双氧水反应显色。
   
    2  结果
   
    2.1  PCR扩增结果  按上述条件扩增出379bp、442bp、279bp的片段，经DNA测序表明它们是BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-F2基因的精确拷贝。
   
    2.2  表达质粒的构建及鉴定  通过反转录PCR从正常人外周血单个核细胞中扩增相应基因片段，克隆入表达载体pET28a(+)，构建重组表达载体pET28a（+）-BCOADC-E2、pET28a（+）-PDC-E2、pET28a（+）-OGDC-E2、pET28a（+）-BPO-E2，重组载体用限制性内切酶酶切鉴定，结果见图1，序列经测定完全正确。再将表达4种融合蛋白的重组体导入大肠杆菌BL21（DE3）中。
   
    2.3  重组蛋白的诱导表达  重组质粒的工程菌经IPTG诱导后进行12%SDS-PAGE电泳，在细菌裂解液（上清液）中可见有一条明显的额外蛋白带，相对分子量为14×103（BCOADC）、18×103（PDC）、10×103（OGDC）、42×103（BPO）（见图2）。

注:Lane 1：含pET28a(+)质粒的细菌裂解液;
Lane 2：含BCOADC重组质粒的细菌裂解液;
Lane 3：含PDC重组质粒的细菌裂解液；
Lane 4：含OGDC重组质粒的细菌裂解液;
Lane 5：含BPO重组质粒的细菌裂解液
M.  Protein Marker
图2  融合蛋白的12%SDS-PAGE电泳图

    2.4  重组蛋白抗原性的鉴定  选取22例M2阳性的病人血清，采用Western-blot方法进行检测，抗BCOADC-E2抗体阳性19例，阳性率为86.4%；抗PDC-E2抗体阳性为21例，阳性率为95.5%；抗OGDC-E2抗体阳性18例，阳性率为81.8%；抗BPO-E2抗体全部为阳性，阳性率为100%。
   
    3  讨论
   
    PBC好发于中老年妇女，男女发病比率约为1∶10，起病隐匿，病程缓慢，病程中可有瘙痒、黄疸、脂肪代谢紊乱、肝脾肿大和贫血，晚期出现肝硬化和肝功能衰竭的各种临床表现。肝功能检查ALP和γ-GT明显升高，血清胆红素升高，以直接胆红素升高为主。据国外研究报道，PBC发病率约为（2～24）/10万，年发病率为（0.4～3.0）/10万，且该数值有逐年递增趋势［6］。近年来国内PBC发病率亦不断增加［7］，PBC人群的易感基因是HLA-DRB1*07［8］，但尚不清楚，这是PBC发病数真正增加还是对该病的认识加强，诊断增加所致。因此，对PBC的早期发现和临床诊断显得尤为重要。AMA中只有M2抗体为PBC特异性抗体，其他亚型可见于很多疾病如药物损害、心肌病、类风湿性关节炎及一些感染如结核、梅毒等。间接免疫荧光法无法对AMA分型，用于诊断PBC的特异性差。本试验检测的22例M2阳性的病人血清中，全部与BPO-E2融合蛋白反应。M2抗原在细胞内含量较少，传统生物化学方法提纯和制备抗原有很大的局限性，操作复杂、成本高，很难获得纯化的线粒体抗原，影响检测结果。而利用本方法可大量获得所需抗原，可用于PBC的免疫学诊断，为PBC的早期发现和临床诊断提供有力工具。

［］

    1  Charatcharoenwitthaya P，Lindor KD.Current concepts in the pathogenesis of primary biliary cirrhosis.Ann Hepatol，2005，4(3):161-175.
    2  Yoneyama K，Yamazaki M，Kogo M.Prognostic factors of primary biliary cirrhosis detected by health screening.Minerva Gastroenterol Dietol，2006，52(1):97-105.
    3  Ishibashi H，Shimoda S，Gershwin ME.The immune response to mitochondrial autoantigens.Semin Liver Dis，2005，25(3):337-346.
    4  Abdul-Aziz K，Faizal AA.Serological diagnosis of autoimmune hepatobiliary diseases.Saudi Med J，2005，26(12):1875-1881.
    5  Persch W，Becker HD.Frequency and prognosis of gastric stump cancer.Front Gastrointest Res，1979，5:170-177.
    6  Metcalf JV，Mitchison HC.Natural history of early primary biliary cirrhosis.Lancet，1996，348(9039):1399.
    7  姚光弼.中国人原发性胆汁性肝硬化的前瞻性研究.肝脏，2002，7:146.
    8  刘海英，邓安梅，张建，等.原发性胆汁性肝硬化患者人类白细胞抗原等位基因多态性分析.中华肝脏病杂志，2005，13(6):410-413.