螺旋藻多糖对HSV-2糖蛋白gB mRNA表达的抑制作用
【关键词】 螺旋藻多糖；单纯疱疹病毒2型；原位杂交
Inhibition of HSV-2 glycoprotein gB mRNA expression by polysaccharide from spirulina platensis(PSP)
【Abstract】 Objective To explore the effects and mechanism of PSP on the expression of HSV-2 gB mRNA and to provide a theoretical support for developing new drugs.Methods PSP was applied at various concentrations to Vero cells infected by HSV-2， In situ hybrization was adopted to explore the expression of HSV-2 gB mRNA with digoxigenin(DIG)-labeled HSV-2 oligoprobe. Results HSV-2 gB mRNA were less expressed in PSP treated group than that in the control (P＜0.01).Conclusion One of the mechanism of PSP against HSV-2 may be explained by the considerable inhibition of HSV-2 gB gene trscription.
【Key words】 polysaccharide from spirulina platensis; HSV-2; in situ hybrization
单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus-2， HSV-2)在人群中感染较为普遍。孕妇生殖器感染可引起早产、流产、死胎、胎儿畸形以及智力低下等，并与子宫颈癌的发生密切相关［1，2］。近几年研究表明：钝顶螺旋藻多糖（polysaccharides from Spirulina platensis，PSP）是钝顶螺旋藻中具有抗肿瘤、抗辐射、抗病毒和免疫调节作用的重要生物活性物质［3，4］。我们的前期实验结果表明，PSP有抗HSV-1的作用，但PSP抗HSV-2的实验研究未见报道。本文研究了PSP对HSV-2糖蛋白gB mRNA表达的抑制作用，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂配制 螺旋藻多糖：参照［5，6］，采用改良的三氯乙酸去蛋白法提取螺旋藻多糖，纯度达92％以上。以双蒸水配成10mg/ml母液，过滤除菌，分装，4℃保存，临用时以DMEM培养基稀释至所需浓度。 细胞培养所用的DMEM干粉培养基为美国GIBCO公司产品，胰酶为Amersco公司产品，新生牛血清为杭州四季青公司产品；地高辛DNA检测试剂盒为Roche公司产品。
1.2 细胞株与病毒 非洲绿猴肾细胞Vero细胞株为本室保存传代细胞系。于DMEM基础培养液中加入10%的新生牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，置5％CO2孵箱中37℃培养，3天传代1次。标准单纯疱疹病毒2型（HSV-2）333株来源于协和医科大学，Vero细胞中传代，毒种保存于-70℃。
1.3 病毒滴度的测定 以TCID50表示病毒毒力。取上述制备好的毒株，做10倍系列稀释，10-1至10-10。将各稀释度的毒株接种于Vero细胞，各6复孔，同时设阴性对照。37℃培养3天后，观察细胞病变，以出现细胞病变的最高稀释倍数的倒数作为TCID50。
1.4 原位杂交检测HSV-2糖蛋白gB mRNA的表达
1.4.1 探针的设计［7，8］ 根据Gen Bank中HSV-2 全基因序列，设计对应于HSV-2糖蛋白gB基因序列的寡核苷酸探针序列为5’-ggcgactttgtgtacatgtccccgttttacggctaccgg -3’，由上海生工公司合成，并于5’末端标记地高辛。
1.4.2 原位杂交［9］ Vero细胞制成2×105/ml细胞悬液，接种在放有盖玻片（飞片）的培养板中，每孔加入1.8ml细胞，于5％CO2孵箱中37℃培养24～48h，弃生长液，加约100 TCID50病毒液50μl，37℃吸附2h，吸出病毒液，加200μl不同浓度的PSP（100μg/ml、50μg/ml和10μg/ml）， 置5％CO2孵箱中37℃培养。24h后，取出细胞飞片经4%多聚甲醛室温下固定20min，PBS漂洗2次，梯度乙醇脱水，蛋白酶K（1μg/ml）37℃消化30min，PBS漂洗2次，2×SSC洗2次，梯度乙醇脱水，空气干燥。每张飞片滴加50μl 杂交液，预杂交2h；加入含探针的杂交液，置于密闭湿盒中，60℃过夜。杂交结束后，飞片在室温下依次经2×SSC、1×SSC、0.5×SSC漂洗各2次，于BufferⅠ洗液中10min，封闭液BufferⅡ中37℃孵育30min，加入抗体液37℃孵育30～60min，BufferⅠ洗液中10min，置BufferⅢ平衡10min，新鲜配制的显色液中避光孵育10min至数小时，终止反应。中性树胶封片。
实验同时设3个阴性对照：(1) 杂交前用Rnase A 100μg/ml预处理细胞飞片，37℃，1h；(2) 加未标记的探针进行反应；(3) 正常的Vero细胞。阳性对照为未加PSP作用的HSV-2感染Vero细胞组。所有操作步骤与其他样本相同。结果判定：400×光镜下随机选择视野，观察200个细胞，计数杂交阳性的细胞数。阳性信号呈明亮的蓝紫色。
1.5 统计学方法 核酸杂交结果以(x±s)表示，多组数据比较采用方差分析。
2 结果
光镜下观察原位杂交结果，可见表达HSV-2糖蛋白gB基因的Vero细胞被染成蓝紫色，染色部位位于细胞浆，而正常Vero细胞未见阳性信号表达（图1）。不同剂量PSP作用的HSV-2感染组，其糖蛋白gB mRNA的表达显著低于阳性对照组（P＜0.01），10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml PSP可使gB mRNA的表达由86.61%分别降至62.29%、46.12%和31.56%（表1）。
表1 PSP对HSV-2糖蛋白gB mRNA表达的影响
注：与阳性对照组比较，**P＜0.01
3 讨论
目前临床应用的抗疱疹病毒药物主要为核苷类衍生物，多通过单一环节抑制病毒复制，如作用于病毒的DNA合成酶，它们以酶反应底物类似物的形式与正常底物竞争，掺入病毒核酸链，造成病毒核酸复制中断，发挥抑制病毒作用，但易产生耐药性、副作用大［10，11］。因此研究作用于病毒基因复制、转录及转译等多环节的药物和制剂是当今国内外开发抗病毒药物的热点。
我们的前期研究工作发现，PSQ对Vero细胞无明显的毒性，可明显阻滞HSV-2向细胞吸附，并有效地抑制病毒复制，但不影响病毒的释放。HSV-2为双股DNA病毒，其复制是一个相当复杂但又十分程序化的过程。已知HSV-2包膜糖蛋白gB是与特异性细胞受体相互作用的病毒配体分子，与病毒吸附有关［1，12］。原位杂交结果表明不同剂量PSP作用的HSV-2感染组，其包膜糖蛋白gB mRNA的表达显著低于阳性对照组（P＜0.01），10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml PSP可使gB mRNA的表达由86.61%分别降至62.29%、46.12%和31.56%，进一步从分子水平直接证明PSP可抑制HSV-2病毒的吸附。
对一些病毒病的，国内外学者主张早期、联合用药，尤其是作用机制不同的药物联合应用，可提高疗效、降低毒副作用。由于PSP为天然化合物，具有无毒、高效的特点，明显不同于常用抗病毒药，同时兼有抗病毒和免疫调节双重作用，在新型抗病毒药物中具有十分重要的意义，也是合成药所不具有的优点。因此，PSP作为一种高效低毒的抗病毒药物，值得进一步研究和开发。
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