疟疾核酸免疫的研究进展
疟原虫生活史有多个时期，每个生活史期有多种抗原，而且每种抗原具有多个表位，有些抗原还有多个等位基因，相同抗原又有多种结构形式，免疫系统有多种作用因子，而不同宿主的免疫反应也不相同，所有的这些因素给疟疾疫苗的研制带来了许多困难[2]。从现有的疟疾疫苗看，疟疾的第一代疫苗——全虫减毒疫苗激发的免疫反应低下，临床试验效果不佳。即使是寄予厚望的第二代疫苗——基因工程亚单位疫苗和化学合成多肽疫苗，也由于表达产物翻译后的修饰功能较差难以确保抗原的天然构型及免疫原性，特别是对保护性抗原多为糖蛋白的虫体生活史时期来说更是难以达到免疫保护效果，同时表达产物的纯化过程也极为复杂，给实际应用带来了困难。因此，近年兴起的核酸免疫为疟疾疫苗的研制带来了希望。核酸疫苗被看作是极具潜力的第三代疫苗[3]。核酸免疫已成为预防和治疗传染病的一种有希望的基因治疗方法，带有病原体抗原基因的质粒DNA直接导入宿主细胞，可激发出针对编码抗原的特异性细胞免疫应答和/或体液免疫应答[4]。在短短的几年中核酸免疫已取得了长足的进展，本文就核酸免疫在疟疾疫苗研制中的应用作一综述。
1 鼠约氏疟原虫的DNA疫苗
1.1 环子孢子DNA疫苗
约氏疟原虫(P,yoelii)环子孢子蛋白(CSP，391aa)(简称为PyCSP)是子孢子表面表达最多的一种抗原，它也可表达于红外期寄生虫的质膜和纳虫泡膜上。PyCSP是保护性免疫应答的靶抗原，过继转移PyCSP特异的CD8+和CD4+T细胞可保护小鼠的子孢子攻击感染。而在体外，PyCSP特异的CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)可以MHC-限制方式消灭培养感染肝细胞，而且针对PyCSP高度显位重复区的抗体可在体外抑制子孢子的侵入，并可被动传递免疫保护作用给未受感染的小鼠[5]。
Sedegah等[6]将重新构建的含有PyCSP基因的质粒DNA直接肌肉注射免疫小鼠，并与辐射减毒子孢子的免疫效果相比较。结果发现，核酸免疫小鼠可发产生抗CSP的特异性抗体和CTL反应，它们的反应水平均高于减毒子孢子免疫的小鼠。核酸免疫小鼠用5×105子孢子进行攻击感染，结果肝期寄生虫的负荷可减少86％；而以102子孢子攻击感染经过2－3次核酸免疫的动物，发现核酸疫苗对68％(18/28)的小鼠具有保护作用，并且这种保护作用依赖D8+T细胞。尽管PyCSP质粒DNA免疫BALB/c小鼠可以剂量依赖形式诱导出高水平的CSP特异性抗体，且比减毒子孢子免疫鼠抗体水平高10－15倍，然而通过体外检测抗体对子孢子侵入肝期的寄生虫生长发育的抑制作用，发现该DNA疫苗诱导的抗体应答只有中等水平的生物学活性。提示，上述DNAU疫苗的保护作用主要依赖于CTL介导的免疫应答。说明核酸免疫可用于抗疟原虫感染。PyCSP质粒DNA免疫可诱导针对PyCSP的一种已被鉴定但尚未命名的CTL抗原特异性表位、MHC限制的CD8+CTL，且CTL应答与抗体应答呈相关关系。PyCSP dNA免疫诱导的CTL的水平(70％－80％特异性溶解靶细胞)明显高于射线减毒子孢子(20％－30％特异性溶解靶细胞)免疫诱导的保护性免疫水平。Hoffman等[7]同样构建了可编码PyCSP基因的重组质粒进行动物免疫试验，获得了与Sedegah等[8]报道相似的免疫效果。同时他们还发现，免疫注射3次(20-40μg/次)质粒DNA可达到与每次注射200μg相同的保护性免疫效应，而且延长免疫间隔期似处可增强免疫效应。
许多研究表明，MHC和非MHC基因可调控小鼠对约氏疟原虫感染的保护作用，而且针对恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、约氏疟原虫及伯氏疟原虫(P.berghei)的CD8+和CD4+T细胞表位和B细胞表位的免疫应答均受遗传基因的限制。因此，为考察DNA疫苗在P.yoelii鼠模型中的保护效果，Doolan等[8]利用能编码PyCSP的质粒DNA免疫5株近交系小鼠，它们的遗传背景和H-2单倍型分别为BALB/c(H-2d)、A/J(H-2a)、B10.BR(H-2k)、B10.Q(H-2q)及C57BL/c(H-2b)。同时还免疫了另一株远交系小鼠CD-1。结果只有BALB/c(H-2d)小鼠获得高效免疫，其抵抗攻击感染的保护率为75％。
1.2 肝细胞红细胞蛋白DNA疫苗
用单克降抗体NYLS3(NYLS3-McAb)在约氏疟原虫感染的肝细胞和红细胞的纳虫泡膜上可鉴定出一种17kDa的蛋白抗原，这种抗原被命名为肝细胞红细胞蛋白(PyHEP17)，它也是保护性免疫应答的靶抗原[9]。NYLS3-McAb可以特异地消灭培养的肝期寄生虫。在体内，被动转移NYLS3-McAb给未感染动物，可以降低原虫血症的虫体数量。Doolan等[8]用肝内及无性血液期均表达PyHEP17的cDNA构建的质粒DNA作为疫免疫小鼠，结果可保护5株近交系中的3株，其单倍型及保护率分别为H-2a，71％；H-2k，54％；H-2d，26％，而且B10.BR小鼠(H-2a)则仅有17％的保护率，C57BL/c(H-2b)则不能保护攻击感染。远交系小鼠CD-1则表现出40％－50％的保护率。但PyHEP17质粒DNA免疫并不能保护小鼠对血液期疟原虫的攻击感染。核酸免疫可在BALB/c小鼠中诱导出抗原特异、MHC限制的CD8+CTL，而A/J或B10.BR则检测不到CTL。与PyCSP质粒DNA免疫不同的是，PyHEP17质粒DNA免疫鼠诱导的CTL与抗体产量并不呈相关关系，因为在所有的5株小鼠中几乎检测不到抗体的产生。
1.3 核酸疫苗的基因调控
上述研究结果表明，PyCSP或PyHEP17质粒DNA免疫诱导的保护性免疫作用受基因调控，且早期的研究证明免疫应答也受基因调控。提示，针对疟疾的单一效价疫苗无法保护遗传背景复杂的远交系动物和人类；即使在近交系小鼠中，PyCSP和PyHEP17质粒DNA的免疫效果也表现出遗传限制的不同保护模式。Doolan等[8]试用上述两种质粒DNA(PyCSP和PyHEP17)的混合物免疫接种，以确定这种遗传限制的免疫保护模式是否可被二价DNA疫苗所阻断。结果发现，在B10.BR小鼠中，单价PyCSP或PyHEP17质粒DNA免疫后的保护分别为8％和54％，而两者的混合物同时免疫则可诱导85％的保护率，在BALB/c和A/J两株小鼠中，经二价疫苗免疫后也表现出明显升高的保护率(80％－90％)，则另外两株小鼠则未能完全保护，从而导致了疟原虫血症的发生，但其出现时间与对照组相比推迟了4天，与其90％的感染肝细胞被消灭相一致。因此，二价DNA疫苗可保护不同遗传背景和H-2单倍型的小鼠，并在B10.BR小鼠中，这种保护作用呈现叠加效应。这些结果提示，小鼠对核酸疫苗诱发的免疫应答受基因调控，单一效价的疫苗似乎很难对不同遗传背景的个体提供完全的保护作用，而二价的DNA疫苗则可以保护不同遗传背景及H-2单倍型的小鼠，同样也只有二价或多价的核酸疫苗方可保护遗传背景更复杂的人类。同时本试验结果还表明，可用与PyHEP17同源的恶性疟原虫基因构建质粒DNA以进行人体恶性疟原虫的免疫研究。
1.4 裂殖子表面蛋白DNA疫苗
约氏疟原虫裂殖子表面蛋白1抗原(PyMSP-1)首先被合成为一种大分子量的前体(190-230kDa，分子量大小与寄生虫种株不同有关)，随后被分解成4个片段[10]。大量的证据表明，在鼠类和灵长类疟疾模型中，PyMSP-1也是一种保护性应答(主要为抗体介导的)靶抗原。Kang等[11]将编码PyMSP-1 c端片段(PyC2)与GST融合蛋白(GST-PyC2)的基因构建成一种质粒DNA疫苗(V3)，将V3免疫BLAB/c小鼠，可成功地诱导产生抗PyC2抗体。这些抗体可免疫沉淀天然的 pyMSP-1蛋白并可与McAb302(针对PyC2的McAb)竞争结合PyMSP-1的表位，这种竞争作用与GST-PyC2蛋白免疫诱发的抗体相似。但是，与GST-PyC2蛋白免疫产生的抗体相比，这些抗体的滴度及亲和力较低，而抗体的同种型构成和抵抗红内期寄生虫的致死性攻击的保护能力也不相同。与蛋白免疫相比，在DNA免疫过程中，GST或PyC2特异的IgG抗体的亲和力也未见明显的增强。这些结果提示，在本试验系统中，DNA免疫期间可能几乎不存在成熟的特异性抗体亲和力。
2 伯氏疟原虫的DNA疫苗
Leitner等[12]用两个表达伯氏疟原虫CSP(PbCSP)水平不同的质粒DNA分别经表皮或肌肉免疫注射BALB/c小鼠，结果表明，延长免疫间隔时间不仅可使抗体的产量增加，而且可增强免疫保护作用。而在经表皮注射的动物中，发现该质粒DNA还可促进CSP特异性IgG同种型IgG1和IgG2a转换，最终两者达到平衡。用基因枪法将高表达质粒经表皮3次免疫动物，每次间隔6周，结果诱导出强烈的体液免疫应答及高水平的保护作用。Gramzinski等[13]用编码用PyCSP的质粒DNA免疫夜猴以进行优化抗体应答方面的研究，结果表明，经皮内途径免疫诱导产生的抗体应答水平与多种抗原肽/佐剂疫苗相似。因此，在夜猴模型中，可应用皮内注射途径进行DNA疫苗的初期研究。同时也表明，该途径适合于诱导针对恶性疟原虫抗原的保护性应答的DNA疫苗研究。
3 恶性疟原虫的核酸疫苗
恶性疟原虫子孢子表面蛋白2(PfSSP-2)是一种表达于子孢子及红外期疟原虫膜表面的抗原，也是保护性免疫应答的一种靶抗原。在体内，过继转移PfSSP-2特异的CD8+T细胞可传递对攻击感染的保护作用。用表达PfSSP-2的肥大细胞瘤细胞被动转移也可传递来自CD8+T细胞的保护作用[14]。
Wang等[15]将分别编码恶性疟原虫PICSP、子孢子表面蛋白-2(PfSSP2)、红外期蛋白(PfEXP2)及肝期蛋白-1(PfLSA1)基因的质粒DNA混合物或编码单一蛋白基因的质粒DNA肌肉注射免疫恒河猴。如果，PfCSP质粒DNA免疫的所有6只猴、PfSSP2质粒DNA免疫的9只猴中的7只、PfEXP2或PfLSA1质粒DNA免疫的6只猴中的5只，它们的外周血单核细胞(PBMC)在体外经抗原刺激均可检测到抗原特异的CTL，且CTL活性受遗传限制，并依赖于CD8+T细胞。本研究首次证明了质粒DNA混合物免疫的灵长类可诱导出针对混合物中所有组分的CD8+T细胞应答，可为人类的多核酸免疫提供基础资料。
Butler等[16]报道了一项临床试验，用疟原虫CSP基因构建的核酸疫苗与佐剂QS21混合，接种免疫志愿者，结果7名经感染有疟原虫的蚊反复叮咬的志愿者中，有6人获得了保护，证实了核酸疫苗的免疫保护效果。
Wang等[17]用编码疟原虫抗原蛋白的质粒DNA免疫注射疟原虫未感染的志愿者，结果表明，该疫苗可诱导出抗原特异的、基因限制的CD8+依赖的CTLs，且这种免疫应答受6个HLA1型等位基因的限制。本研究首次证明DNA疫苗可诱导未感染健康人产生CD8+CTLs。同时也证明在同一个体中，CTLs受多个HLA等位基因限制。这些证据将为这种革命性疫苗技术用于人体的进一步研究提供基础资料。
4 优化疟疾DNA疫苗的策略
4.1 优化免疫方案
核酸疫苗在诱导体液应答、CTL应答及保护作用的免疫途径、剂量、次数及其间隔等仍未得到解决，但它们都可能影响核酸疫苗的免疫效果。正如Sedegah等[6]在PyCSP dNA疫苗免疫的试验中，发现抗体的应答水平大约与质粒DNA剂量成正比，而且PyCSP质粒DNA疫苗经2－3次免疫(间隔2－3周)可诱导出对子孢子攻击感染的保护作用，若再进行第四次免疫，结果可引起Th1型免疫应答向Th2型免疫应答转化。除上述影响因素外，研究还发现动物的发育程度也能影响疫苗的效果。Mor等[18]将具有保护作用的质粒DNA[6]用来免疫2－5日龄小鼠，发现它们不仅不能诱导免疫效应，反而诱导了免疫耐受。这种新生期免疫耐受的动物体内经DNA疫苗再次免疫无法诱导出抗体、细胞因子或细胞毒应答。这种耐受特异针对由核酸疫苗编码表达的内源性抗原的免疫原表位，而经外源CSP免疫的小鼠可产生针对不同表位的抗体，而不发生免疫耐受。这些结果表明，与传统的蛋白免疫原相比，DNA疫苗诱发的免疫应答在性质、特异性方面有着明显的差异。
4.2 改善DNA疫苗的载体
DNA疫苗研究的最终目的在于利用它来保护人体以抵抗疟原虫感染，因此安全性显得非常重要。为避免外源基因整合进人体细胞染色体中，研究人员在构建载体时将一些病毒DNA序列如SV40的复制起始点剔除掉。同时也可插入一些有利于靶抗原基因表达的序列，如Haddad等[19]构建了可编码疟疾抗原Pf322的质粒DNA，同进在此质粒DNA中编码靶抗原基因的前方插入人体组织纤溶酶激活物(tPA)信号序列。首先在体外分别用含有或缺乏tPA信号序列的质粒DNA转染COS细胞，并用布雷菲尔德菌素A处理转染子。结果表明，只有编码有信号肽的质粒转染的细胞通过质内网和Golgi体通路分泌靶抗原。分别用这种质粒重复肌肉注射小鼠，结果诱发的针对靶抗原的抗体应答在动力学、特异性IgG水平及持续时间上都有明显的区别，这些结果提示，这两种质粒体内转染肌肉细胞产生的B细胞可识别及抗原提呈细胞(APC)可摄取的靶抗原水平也明显不同。
4.3 修饰抗原序列以改变抗原表达的定位及免疫原性
改变DNA疫苗抗原表达的定位可用于改变该抗原的免疫原性。免疫学研究已经证明，非分泌性抗原必须通过MHCⅠ类途径优先处理和提呈才能激发CD8+T细胞介导的免疫应答，而分泌性抗原只能通过促进APC摄取以及MHCⅡ类途径提呈从而诱发体液应答。另外，也可通过改变抗原的氨基酸序列改变抗原免疫原性[20]。
4.4 免疫应答的改变
优化免疫应答可通过如下方法进行，应用编码有细胞因子或协同刺激因子的质粒来调控免疫应答。Weiss等[21]分别构建了编码PyCSP基因的质粒DNA——PyCSP1012和鼠CM-CSF基因的质粒DNA。结果发现，单独以PyCSP1012免疫小鼠，其保护率为28％；与GM-CSF质粒DNA同时免疫则保护率可提高到58％；与编码无活性的GM-CSF的质粒DNA同时免疫则不能提高其保护性；而GM-CSF质粒DNA单独免疫也没有保护性。GM-CSF质粒DNA在PyCSP1012免疫中的免疫促进作用表现为，它可提高PyCSP的IgG1、IgG2a及IgG2b的产量，而不能促进IgG3或IgM的产生；同时它也可增强CD8+T细胞针对PyCSP280－288aa表位的IFN-γ应答增强，但CTL活性没有发生变化。最引人注目的是，PyCSP1012质粒DNA和GM-CSF质粒DNA同时免疫可提高抗原特异的IL-2的产量，并促进抗原特异CD4+T细胞的增生，提示GM-CSF质粒DNA可能作用于树突状细胞进而促进PyCSP抗原的提呈，然后IL-2产量的增加及CD4+T细胞活性增强促进了抗体和CD8+T细胞的功能。重组GM-CSF已应用于人体的临床，因而GM-CSF蛋白或其质粒DNA可用作DNA免疫的一种增强剂。
5 结 语
DNA免疫技术为疟疾疫苗的研制开拓了一条前所未有的新途径。自此项技术应用于疟疾核酸疫苗的研制后，在短短的几年间，已有多种DNA疫苗使用于动物模型的研究，并可诱导出CD8+T细胞应答。研究表明，用二价DNA疫苗或多价疫苗或多种单价疫苗联合免疫有可能克服远交系动物因遗传背景而限制的免疫应答。尽管如此，在设计与构建能诱导保护性免疫应答的核酸疫苗方面尚存在许多问题。从疟疾基因组计划[22]可获得许多基因的信息，并很快在DNA疫苗研制中得到了应用。另外，应用基因技术可从基因库中鉴定并筛选出可编码保护性抗原的基因[23]，也将有利于疟疾疫苗的研制。
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