灯盏花提取成分对体外高压培养视网膜神经节细胞凋亡基因表达的影响
［关键词］ 视网膜神经节细胞；细胞培养；压力；细胞凋亡
Apoptotic genetic expression of RGCs by bolting constituent from Herba Erigerontis cultured in vitro by high pressure
［Abstract］ Objective To observe the apoptosis and look for apoptotic gene of RGCs cultured in vitro by high pressure by adding the constituent come from Herba Erigerontis（DSX）. Methods We build rat retinal cells and RGCs cultured in virto by high pressure.Put 80 mmHg pressure to RGCs in close tightly culture?bottle for four hours， then collect RGCs and check the sum of apoptosis cells by flow cytometry(FCM).Put the pressure 80 mmHg to RGCs in close tightly culture?bottle for four hours，then collect RGCs and look for the apoptotic gene by gene chip. Results The apoptosis of model group and control group higher than DSX group cultured in the pressure of 80 mmHg.Two apoptotic gene (S100B，NGFR) express up?regulation. Conclusion DSX was the most effective constituent in protecting RGCs in vitro.The expressing up?regulation of S100B and NGFR is the direct reasons of the apoptosis of RGCs by pressure.
［Key words］ retinal cells;retinal ganglion cells; cell culture;pressure;apoptosis
青光眼系具有病理性高眼压或正常眼压合并视乳头、视网膜神经纤维层损害及青光眼性视野改变的一种致盲性的眼病，目前临床疗效不理想，尤其是控制眼压后，患者视功能仍然继续下降，所以寻找对视神经具有保护作用的药物成为新的要求。DSX是从中药灯盏花中提取的有效成分。目前已证明以DSX为主要组分制备的优视胶囊具有活血化瘀、通窍明目的作用，能保护高眼压状态下的RGCs免受或少受损伤并挽救凋亡细胞［1，2］，在此基础上，我们希望能明确其作用机制，为进一步研究的剂型做准备。
1 材料与方法
1.1 实验动物 SD乳鼠（1~3日龄），由成都中医药大学动物实验中心提供。
1.2 主要试剂 层粘连蛋白（ROCHE公司）、多聚鸟氨酸、硼酸、硼砂（沈阳化学试剂厂）、胰蛋白酶、DMEM培养基（GIBCO公司）、羊抗鼠IgG（华美生物工程公司）、小鼠抗大鼠单克隆抗体和PI（SIGMA公司）、DEPC（Sigma公司）、trizol（Invitrogen公司）、EDTA?Na2（国药集团化学试剂有限公司）NucleoSpin? RNA clean?up试剂盒（MACHEREY?NAGEL，Germany）等。DSX由中药灯盏花提取。
1.3 主要仪器 HBO50型倒置相差显微镜（德国ZEISS公司）、超净工作台（苏州医疗器械厂）、MCO-150A型二氧化碳培养箱（日本三洋公司）、大鼠Oligo芯片、LuxScan 10KA双通道激光扫描仪（CapitalBio公司）等。
1.4 培养器皿的制备 25 cm2培养瓶和直径35 mm培养皿（内置盖玻片），以0.1 mg/ml多聚鸟氨酸（poly?L?ornithine，硼酸缓冲液稀释）室温包被2 h后，再以4 μg/ml层粘连蛋白(laminin， PBS液稀释)包被，37 ℃过夜备用。以羊抗鼠IgG（1∶100，PBS液稀释）室温包被培养皿24 h，继以小鼠抗大鼠Thy-1.1单克隆抗体（1∶150，PBS液稀释）室温包被24 h。
1.5 RGCs的培养 出生1~3天SD乳鼠20只断头处死，无菌条件下取眼球，体视显微镜下钝性分离视网膜，0.125%胰蛋白酶消化20 min，用220目网眼无菌钢网滤过，小牛血清终止消化，1000 r/min离心5 min，去上清，加20%DMEM培养液，用吸管反复吹打，使细胞分散均匀，制成细胞悬液后加入经羊抗鼠IgG和小鼠抗大鼠Thy-1.1单克隆抗体包被的培养皿，37 ℃条件下孵育30 min，使视网膜神经节细胞与Thy-1.1单克隆抗体充分结合，去上清，用无血清培养液反复漂洗，清除培养皿表面未黏附的细胞，用0.125%胰蛋白酶消化10 min，小牛血清终止消化，1000 r/min离心5 min，去上清，加20%DMEM培养液，用吸管反复吹打，使细胞分散均匀，制成细胞悬液。计数后按每瓶5×105个细胞加入经多聚鸟氨酸和粘连蛋白包被的培养瓶和培养皿。
1.6 视网膜神经节细胞体外培养 按以上方法制备的纯化RGCs，培养24 h后，取出培养皿内置的盖玻片，固定，用Pischinger法进行鉴定。
按以上方法制备的纯化RGCs 18瓶，培养24 h后随机分为3组，实验组加入DSX（终浓度0.1 mg/ml），模型组和空白对照组不加药物，实验组和模型组用带T型三通管的橡皮塞将培养瓶密闭，用打气球从T型三通管注入除菌空气，从与培养瓶相通的压力表中读取压力值，达到预定的80 mmHg，加压时间4 h，空白对照组不加压，37 ℃，5%CO2孵箱培养，并在规定时间取出，利用流式细胞仪进行凋亡细胞的检测。
按以上方法制备的纯化RGCs 30瓶，培养24 h后随机分为3组，每组10瓶，实验组加入DSX（终浓度0.1 mg/ml），模型组和空白对照组不加药物，实验组和模型组用带T型三通管的橡皮塞将培养瓶密闭，用打气球从T型三通管注入除菌空气，从与培养瓶相通的压力表中读取压力值，达到预定的80 mmHg，加压时间4 h，空白对照组不加压，37 ℃，5%CO2孵箱培养，并在规定时间取出，利用基因芯片进行凋亡基因的检测。
1.7 统计学方法 采用SPSS 14.0版统计软件包进行统计，多组间比较用单因素方差分析，多组间两两比较用q检验，差异基因的表达用t检验。
2 结果
2.1 视网膜神经节细胞的鉴定结果 Nissel小体染色检查：免疫组化染色结果显示细胞胞浆内有蓝色颗粒，证实细胞类型为神经元细胞。因此，依据细胞的组织来源、细胞的形态以及免疫组化染色结果可判断此种细胞为视网膜神经节细胞。
2.2 视网膜神经节细胞的存活状况 相差显微镜下观察，细胞于培养3 h开始贴壁，贴壁后的细胞呈圆形，胞体中部较暗，光晕明显。24 h细胞伸出粗细长短不等的突起。细胞呈多边形，大多数细胞质折光强，细胞分布稀疏分散，无聚集生长的现象；高压的神经节细胞核膜收缩成新月体状，核体积减小，细胞体积缩小，表面起泡，成不规则形状。
2.3 DSX对高压培养视网膜神经节细胞凋亡的影响 见表1。模型组的细胞凋亡百分率高于空白对照组的细胞凋亡百分率，差异有非常显著性（P<0.01）。DSX组凋亡百分率低于模型组、高于空白对照组，差异均有非常显著性（P<0.01）。表1 DSX对高压培养视网膜神经节细胞凋亡的影响注：与空白对照组比较，★★P<0.01；与模型组比较，▲▲P<0.01
2.4 DSX对高压培养视网膜神经节细胞凋亡基因表达的影响 见表2。与空白组比较，模型组有2个与细胞凋亡相关的基因S100B、NGFR表达上调，与模型组比较，实验组的S100B表达恢复正常，NGFR表达下调。表2 DSX对高压培养视网膜神经节细胞凋亡基因的影响
3 讨论
S100B蛋白是一种钙传感器蛋白，在细胞增殖、分化、能量代谢、传导细胞内信号及细胞凋亡中发挥重要的作用［3，4］，编码S100B蛋白的基因位于人类染色体21q22.2～q22.3，含有3个外显子和2个内含子，其mRNA由1095bp组成，编码91个氨基酸的S100B蛋白。体外实验证明S100B蛋白多通过与钙结合发挥其生理作用［5］。高浓度的S100B蛋白有神经毒性，细胞培养研究表明，S100B蛋白参与NO介导、细胞因子依赖的神经元致死途径。S100B浓度过高则导致神经元凋亡［6］。
NGFR作为一种经典的神经营养因子在轴突的生长和细胞的存活方面起着非常重要的作用，并能促进损伤后神经元再生。神经系统损伤后，NGF效应神经元表达NGFR增加，而且靶区NGF的水平也明显升高。实验证明P75NTR可选择性地导致细胞程序性死亡，在神经系统中扮演凋亡使者的角色，而此作用能够由于其结合了NGF而被抑制［7］。NGF与P75NTR结合后能促使细胞内的NF?κB的激活，可能对细胞凋亡起拮抗作用。
药理研究证明灯盏花具有舒张脑血管、抗脑缺血、改善微循环、降低全血黏度和血浆纤维蛋白原等作用［8］。目前已广泛用于脑梗死［9］、糖尿病周围神经病变［10］等方面。眼科用于包括视网膜静脉阻塞、缺血性视神经病变、视网膜动脉阻塞外伤性视神经病变在内的眼底病［11］等疾病。对大鼠实验性高眼压的也研究表明灯盏细辛注射液具有改善大鼠实验性高眼压后视神经轴浆运输的作用［12］。本实验利用体外高压培养的视网膜神经节细胞，探讨DSX的细胞保护作用，发现DSX的作用途径可能是抑制S100B蛋白的表达增加，具有类似神经营养因子的作用，使神经营养因子受体NGFR表达下调，从而起到抑制RGCs凋亡，保护RGCs的作用。
［］
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