婴幼儿病毒性肺炎病原检测分析

关键词：荧光免疫法；呼吸道合胞病毒；婴幼儿；鼻咽分泌物 

    【摘要】 目的 了解天津市地区3岁以下婴幼儿病毒性肺炎的病原分类。方法 对天津市儿童自2005年10月～2006年4月住院的2038例急性呼吸道感染患儿采集的鼻咽分泌物用荧光免疫法（IFA）进行7种呼吸道病毒的快速检查。结果 2038例患儿中，阳性标本790例，占38.7％。790例阳性标本中呼吸道合胞病毒感染742例，占93.9％。结论 呼吸道病毒是造成儿童呼吸道感染的主要病因，而在3岁以下婴幼儿中，病毒性肺炎的病原以呼吸道合胞病毒为主，0～3岁的婴幼儿的感染率明显高于3岁以上的儿童，呼吸道病毒感染季节分布明显。
    【关键词】 荧光免疫法；呼吸道合胞病毒；婴幼儿；鼻咽分泌物
    Detecting and analysis about the pathogen of viral pneumonia in children and infan
    【Abstract】 Objective To explore the pathogen of viral pneumonia in children and infant below 3 year-old in Tianjin area.Methods Examination the nasopharyngeal secretion from 2038 acute respiratory tract infection patients hospitalized from Oct 2005 to Apr 2006 by IFA（immune fluorescence assay）， which can find out 7 virus immediately.Results In 2038 children patients， positive is 790，with a ratio of 38.7%. In all these positive sample， RSV （ respiratory syncytial virus ）positive is 742， with a ratio of 93.9%.Conclusion Respiratory virus is the main pathogen of respiratory tract infection in children， and below 3-year-older children the RSV is the main causing of viral pneumonia. The infectious opportunity is much higher below 3-year-old contrast to children which older than 3， seasonal distributing can be observed markedly.
    【Key words】 immune fluorescence assay; respiratory syncytial virus; children and infant; nasopharyngeal secretion
    急性呼吸道感染（acute respiratory tract infections，ARI）是儿科常见病，目前已证明95％的急性上呼吸道感染和大部分的下呼吸道感染是由细菌以外的病原体引起，其中以呼吸道病毒最常见。3岁以下婴幼儿中以呼吸道合胞病毒（RSV）为主，RSV感染常年均有发病，冬春季为流行高峰， 3岁以下小儿易感率高，临床表现以低热、下呼吸道病变多见，婴幼儿多阵咳、喘憋症状明显。并呈一定的季节流行趋势，且各地区的流行状况又不尽一致。以下报告天津市儿童医院自2005年10月～2006年4月用荧光免疫法（IFA）对住院的急性呼吸道感染的患儿进行的7种呼吸道病毒的快速检查结果。
    1资料与方法
    1.1 对象 选择2005年10月～2006年4月因呼吸道感染入院的3岁以下患儿2038例，男1405例，女633例;年龄6天～3岁。
    1.2 材料 荧光显微镜（型号：Nikon TE 2000-U ），离心机（型号：Beckman COULTER Allegra X-22 ），旋涡混合器（型号：QL-901），37℃恒温箱（型号：HH-B11海河），一次性婴儿吸痰器，七孔玻片，病毒诊断试剂盒（Diagnostic Respiratory Inc，D3-DFA Respiratory Virus Screening USA）。 
    1.3 方法
    1.3.1 标本采集及处理 由实验室工作人员到床旁用一次性婴儿吸痰器导管经鼻腔插入气管7～8cm，负压吸取1～2ml分泌物置于含6～8ml PBS的离心管充分混合。立即送回实验室用旋涡混合器充分振荡， 2000r/min离心15min，弃去上清，沉淀物中再加入6～8ml的PBS，用玻璃滴管反复吹打，直至黏液均呈泡沫状。再次2000r/min离心15min，弃去上清，保留沉淀物。如沉淀较少或不可见，则只留大约0.5ml PBS，用玻璃滴管将悬液吹打至淡云雾状（如仍有黏液可用上述方法再洗1次）。
    1.3.2 细胞片制备 用尖头滴管吸取上述悬液，滴于已备好的七孔玻片上，每孔滴加约25μl，室温下空气干燥，用4℃丙酮固定10min。
    1.3.3 Chemicon免疫荧光试剂染色 用内含伊文斯蓝荧光素标记的RSV、ADV、 FluA、FluB、PIV1、PIV 2、PIV 3型单克隆抗体各25～30μl分别滴加于上述已备好的细胞片上，37℃孵育30min，用PBS/Tween洗片3次（1min－3min－3min），再用蒸馏水洗片1min。空气干燥后用封片剂（pH 8.5甘油缓冲液）封片。荧光显微镜下观察。 
    1.3.4 阳性结果判定 每视野呼吸道上皮脱落细胞≥20个，其中细胞核和（或）胞浆内可见明亮的黄绿色荧光和（或）荧光斑点数目≥2个为阳性。否则为阴性。试剂盒内提供阳性及阴性质量控制对照片与标本同时染色。
    1.3.5 统计学处理 各组感染阳性率使用四格表χ2 检验。
    2结果
    2.1 阳性标本 检测的2038例标本中阳性标本790例，占38.7％。
    2.2 各性别组的阳性例数及总阳性例数 经χ2检验显示，性别和病毒感染的阳性率差异无显著性（χ2=3.69，P>0.05），见表1。表1各性别组呼吸道感染阳性率（略）
    2.3 各年龄组的阳性率 经χ2检验显示，0～3岁四个年龄组感染阳性率差异有显著性（χ2=12.35，P<0.01）。2岁以内各组差异无显著性（χ2均<3.84，P>0.05）。<2岁的三个年龄组的阳性率与2～3岁相比差异均有显著性（χ2值为10.53，9.1，8.55。P<0.01），见表2。表2各年龄组呼吸道感染阳性率（略）
    2.4 呼吸道病毒感染的季节分布 从图1可见，2005年11月～2006年3月间，为呼吸道病毒感染高发季节（见图1）。而2005年4月～2005年11月间呼吸道病毒阳性患者仅为散发（<10例）。图1 呼吸道病毒感染的季节分布（略）
    χ2检验显示各季节呼吸道病毒感染的阳性率差异有显著性（χ2=155，P<0.01），见表3。呼吸道病毒感染尤其是合胞病毒的感染主要集中在11月份中下旬至4月份上旬。表3各月份呼吸道感染阳性率 （略）
    2.5 呼吸道病毒的构成 分析2038例患儿中，阳性标本790例，占38.7％。790例阳性标本中呼吸道合胞病毒感染742例，占93.9％，且多集中于冬春季节（11～4月）；流感病毒A共30例，占3.8％，各月均为散发，在2005年11～12月有短暂流行趋势；副流感病毒共12例，占1.5％，腺病毒6例，占0.8％，冬春季节发病率极低，且均发生于11月以前及3月以后。其感染病毒的具体构成见示意图2。   图2 呼吸道病毒感染病毒种类示意图（略）
　3 讨论
    人类呼吸道合胞病毒（hRSV） 是婴幼儿下呼吸道感染最常见的病原之一，健康儿童第1 次感染RSV 后约有1/ 3 发生下呼吸道疾病，0.5 %～2%病例因症状严重需住院［1］。RSV 属副黏液病毒科，电镜下所见与流感病毒类似，因其在组织培养中能形成特殊的细胞融合病变而得名。RSV感染非常普遍，90%以上的儿童在2 岁以前感染过RSV。RSV 引起的下呼吸道感染多见于3 岁以下， 发病高峰为2～6 个月，1～6 个月可见较重病例，男多于女［2］。RSV 是世界各地婴幼儿急性下呼吸道感染最重要的病毒病原，流行面广，发病率高［3］。 在我国还是引发流行性喘憋性肺炎的主要病原，可引起婴幼儿尤其是新生儿较高的死亡率［4］。 其与支气管哮喘的发作也存在相关性［5］。RSV 因其抗原性不同可区分为A 和B两个亚型，其亚型与疾病的严重程度之间的关系目前尚无定论［6］。
    本文检测了7种常见的引起婴幼儿肺炎的病毒，病毒检出的阳性率达38.7％。病毒构成比显示：阳性标本以RSV占首位，达93.9％，较往年的其他地区RSV的感染率（81.6％）明显偏高［7］。分析呼吸道病毒感染和性别季节的关系显示，男、女感染率差异并无显著性，但男性患者数量上明显高于女性。在季节分布上，冬春季感染率明显高于夏秋季。
    此前许多曾报告各年龄组儿童呼吸道病毒感染的阳性率差异无显著性［8］，本文结果显示，0～2岁的婴幼儿的呼吸道病毒感染率明显高于2～3岁幼儿和3岁以上的儿童，与最新的关于呼吸道病毒的研究文献一致［2］。3岁以上的学龄前期和学龄期，随着机体的免疫功能不断加强，病毒感染也有显著下降，以上说明婴幼儿期应是病毒感染的重点防御时期。另外，不同呼吸道病毒感染好发季节显示，流感病毒散发于全年的各月，仅在冬季（11～12月）有短暂流行趋势；腺病毒的感染集中于2005年的1～10月；副流感病毒主要以副流感病毒1和副流感病毒3为主，多发生在春夏季。
    急性上呼吸道疾病和大部分的下呼吸道疾病是由病毒所引起，呼吸道病毒检测在加强小儿呼吸道疾病病原学诊断、有效防止交叉感染及抗生素的滥用、加强流感的流行病学监测及疫苗的研制等方面具有深远的临床意义。美国DHI公司D3-DFA呼吸道病毒诊断方法率先经FDA认证，结果良好，本方法特异性达86％，敏感性达95％，而且此方法明显较其他方法需时更短，而设备仅需荧光显微镜。故开展呼吸道病毒的快速检验可以及时地为临床诊断和治疗提供更可靠的依据。而且，明确各个病毒的季节性及易感人群。更可以指导临床医师在流行季节中更合理地使用抗病毒药以及采取更加积极的预防措施。
    【文献】
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    2 张海邻，金可，陈小芳，等. 婴儿特应性体质与呼吸道合胞病毒感染关系的研究. 浙江临床医学，2004，6（7）：551.
    3 Collins PL， Chanock RM， Murphy BR. Respiratory syncytial virus. in： Fields Virology. 4th ed. Lippincontt： Willians &W ilkins， 2001： 1443-1484.
    4 赵林清，钱渊，王之梁，等.呼吸道合胞病毒检测方法比较.临床儿科杂志， 2003，21（1）：20-24.
    5 朱毅.呼吸道病毒感染与哮喘.临床肺科杂志， 2002，7（1）：39-40.
    6 Neves BJ，Fonseca C，Cardoso M， et al. Relationship between respiratory syncytial virus subtype and clinical severity in bronchiolitis. An Esp Pediatr， 2001， 54 （6）： 559-566.
    7 陈小芳，董琳，周晓聪，等.306例儿童急性呼吸道鼻咽分泌物病毒病原检测.温州医学学报，2004，34（2）：108-110.
    8 顾伟忠，曾群，汤宏峰，等.直接免疫荧光法对呼吸道分泌物多种呼吸道病毒检测的临床意义.实用儿科临床杂志，2004，19（10）：857-858.