一种提高组织DNA抽提得率的方法

【摘要】  目的  采用常规酚-氯仿抽提法方法提取组织DNA，通过延长水浴时间提高提取DNA得率。方法  各组设置不同的水浴时间，比较所提DNA得率。结果  用酚-氯仿提取肝脏DNA，随着水浴时间的延长（2.5～7.5h），DNA提取得率由每100mg肝脏组织中得到341.4μg提高到701.9μg。结论  该方法适用于用酚-氯仿对少量组织需提取较大量DNA的实验，为下一步的实验研究做准备。
     
　　【关键词】  酚-氯仿;DNA得率
             
　　基因组DNA在分子生物学研究中应用广泛。酚-氯仿提取组织DNA的方法从上个世纪八十年代开始应用，以其操作简便，效果好而一直方兴未艾。本实验旨在对酚-氯仿提取组织基因组DNA的过程加以改进，从少量组织中提取较大量DNA，用于下一步实验研究［1］。
 
　　1  材料与方法
 
　　1.1  材料  每个样本取SD大鼠肝脏0.1g，共做24个样    本，以8个样本为一组，每组水浴时间不同，Ⅰ组水浴2.5h；Ⅱ组水浴5h；Ⅲ组水浴7.5h。
 
　　1.2  主要试剂  细胞裂解液：30mM Tris-HCl，0.1mM       EDTA，0.1  mM NaCl，pH 8.0；10mg/ml蛋白酶K、SDS、饱和    酚、氯仿、异戊醇、无水酒精、1mol/L   TE缓冲液。
 
　　1.3  方法
 
　　1.3.1  酚-氯仿提取组织基因组DNA［2］  (1)取100mg肝脏加1ml细胞裂解液，用玻璃匀浆器匀浆；(2)匀浆液倒入2ml塑料离心管中，加20μl蛋白酶K，再加SDS至终浓度为1％，上下颠倒混匀；(3)混合液置于55℃水浴，水浴时间分别为Ⅰ组2.5h、Ⅱ组5h、Ⅲ  组7.5h；(4)水浴完毕后，向匀浆液中按1：1比例加酚/氯仿/异戊醇混合液（25：24：1），轻轻震荡混匀5min，12000g离心5min；(5)吸上层水相800μl于一灭菌塑料离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，轻轻震荡混匀5min，12000g离心5  min；(6)吸上层水相500μl于一塑料离心管中，加入两倍体积的无水乙醇，-20℃放置2h或液氮中放置5min；(7)12000g离心5min，沉淀DNA,倾去上清液；(8)于沉淀中加入75%乙醇溶液500μl，轻轻混匀后12000g离心5min，倾去上清液，室温凉干；(9)向DNA沉淀中加200μl TE缓冲液，-20℃保存备用。
 
　　1.3.2  DNA纯度和浓度的测定  取10μl TE溶解的DNA溶于2500μl双蒸水中，用国产UV-754分光光度计测260nm和280nm吸光值，OD值和提取DNA的浓度和纯度。
 
　　1.3.3  统计学处理  对三组样本的得率进行统计学处理，各组间检测数据均由均数±标准差表示；组间均值的比较用单一因素方差分析（ANOVA）处理。
 
　　2  结果
 
　　Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的DNA样品浓度和纯度检测结果分别见表1、表2和表3。
 
　　表1  各样本水浴2.5h提取DNA的各项数据　略
 
　　表2  各样本水浴5h提取DNA的各项数据　略
         
　　表3  各样本水浴7.5h提取DNA的各项数据　略
     
　　对三组样本的DNA得率进行比较和统计学分析结果见表4。
 
　　表4  不同水浴时间酚、氯仿提取DNA得率比较  （略）
       
　　结果显示，用酚、氯仿提取肝脏DNA，随着水浴时间的延长（2.5～7.5h之间），DNA提取得率提高。Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅱ组与Ⅲ组、Ⅰ组与Ⅲ组间所提DNA得率的比较，各组间均  差异有显著性。
 
　　3  讨论
 
　　本研究采用组织DNA的酚-氯仿提取方法，在一定时间范围内（2.5～7.5h），改变水浴时间，随着水浴时间的延长，得到较多的DNA，可以更好地满足进一步实验的需要。对实验结果分析后发现，在酚-氯仿提取组织DNA的过程中，延长水浴时间后，在细胞裂解液、蛋白酶K和SDS的充分作用下，肝细胞裂解更充分，更多DNA从细胞中释放出来，提高了DNA得率。据报道，采用酚-氯仿提取石蜡组织DNA，水浴时间高达16h以上，说明水浴对于DNA提取非常重要。从理论上讲通过延长水浴时间至7.5h可获得更多的组织DNA，但是延长水浴时间同时会增加DNA降解率。因此，将水浴时间定为多少可提取质量好、最大量的DNA尚需进一步的实验研究。
 
　　本实验的优点：  （1）当组织量少又需获得较大量的DNA时，采用此方法简便易行。  （2）方便所提DNA的纯度和浓度。国内实验室一般采用国产紫外分光光度计测量所提取DNA在260nm和280nm处的吸光值。计算出其所提DNA的浓度和纯度。本实验采用国产UV-754紫外分光光度计测量DNA在260nm和280nm处的吸光值，该仪器在DNA样本透射比在20％～80％时其测量值较准确（透射比与DNA的浓度成反比）。提取的DNA得率高时，可以将其稀释至一定比例，在该仪器的敏感范围内准确测其260nm和280nm处的吸光值，从而计算其浓度、得率和纯度。提取的DNA得率低时，其透射比不在该仪器的敏感范围内，故不能准确测其260nm和280nm处的吸光值，从而不能准确计算其浓度、得率和纯度。笔者曾用试剂盒提取组织DNA，由于提取的DNA得率低而无法准确计算样本的浓度、得率和纯度。在采用酚-氯仿法提取组织DNA过程中，通过延长水浴时间可以很好地解决此困扰。（3）使PCR的反应更加严密。通常提取DNA量少而无法计算其浓度和纯度时，在进行PCR实验中往往采取将模板稀释10倍、50倍、100倍等方法，并对每个样本都进行模板量的摸索，在这个过程中浪费了大量的时间、物力和财力。提高DNA的提取量，准确计算其浓度和纯度，在进行PCR实验中将模板DNA的使用量量化，可以减少预实验次数，使PCR的反应更加严密准确。
 
　　本实验在提取DNA的过程中注意以下几点：（1）震荡过程中一定要手法轻柔以减少长链DNA的断裂机会。（2）离心一定要好，尽量减少提取的DNA混有的蛋白含量。（3）采用800μl：500μl：200μl的提取上清液的梯度，将DNA中的蛋白质去除干净，并保证最大量地提取DNA。
 
　　本实验采用酚-氯仿提取组织DNA，通过延长水浴时间来提高基因组DNA得率，为PCR后续实验的成功打下了坚实的基础。
 
　　【文献】
 
　　1  李学英，王大忠，王乾兴.一种改进的鲇鱼(Silurus asotus and Silurus meridionalis)基因组DNA的高效提取方法.遵义医学院学报，2001，（1）：19-21.
 
　　2  卢圣栋.分子生物学技术.北京：高等出版社，1993，89-130.