羊水细胞培养技术在产前诊断的应用
［关键词］ 羊水;细胞培养;产前诊断
羊水细胞培养及染色体制备是染色体病产前诊断的主要手段。由于羊水细胞培养一直存在技术要求高、难度大、培养时间长、易污染、分裂相较少等问题,许多单位仍未能开展羊水产前诊断工作。近10年来,世界各地对羊水细胞的培养及其在染色体制片上虽不断有所改进,但羊水细胞培养与制片仍有一定难度。近3年来,我们对羊水细胞培养方法进行了探索和改良,并进行了270例羊水染色体的制备,效果满意,现报告如下。
1 资料与方法
1.1 病例来源 200例为陕西省妇幼保健院遗传优生及产前诊断门诊中有产前诊断指征的患者，70例为外院送检患者。
1.2 方法
1.2.1 羊水采集 在孕17周～23周进行穿刺。常规消毒,B超引导下采用22号穿刺针穿刺,最初抽取的1 ml～2 ml羊水弃去,换另一注射器抽取羊水20 ml～30 ml,注入无菌离心管中送检。羊水中少量红细胞不需处理,如有明显血性羊水,立即在羊水中加入无菌肝素1滴，标本尽快送实验室接种。
1.2.2 羊水细胞培养 将羊水以1 200 r/min～1 500 r/min离心10 min,弃去上清液,保留0.5 ml羊水细胞层,以滴管打匀,接种于125 cm2培养瓶(鼎国公司提供),并加入羊水培养液3 ml（Amnio Max）混匀,置于5% CO2培养箱中半开放式培养。第5天开始观察，若观察到有较好的梭形细胞克隆则更换培养液。用一次性滴管吸干原来的培养液后,加入新鲜培养液4 ml。于收获前1天或收获当天再换液1次。收获时在培养终止前3 h加入秋水仙素,最终浓度为25 μg/ml。
1.2.3 羊水细胞收获 收获细胞时,根据细胞生长旺盛程度采取收获方法。在细胞生长相对量少时，采用原位法。将培养液倒出，加入0.6%的柠檬酸钠10 ml于培养瓶中37.0 ℃ ，低渗40 min，弃液，用3∶1甲醇冰醋酸固定液固定2次后，敲开培养瓶，获取培养瓶细胞生长面塑料片1张～2张，55 ℃烤片过夜。在细胞生长相对量多时，用吸管将细胞吹打后倒入离心管中,在每个离心管内加入8 ml已预温至37 ℃的0. 6%枸橼酸钠低渗液,每管低渗10 min,用3∶1甲醇冰醋酸固定液固定后，滴片1张～2张,55 ℃烤片过夜。胰酶法G显带。按照人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN1995)标准进行核型分析诊断。
2 结果
2.1 成功率 270例标本中, 成功260例, 一次性培养成功率达到96.30%。
2.2 培养时间 培养收获时间大多数为9 d～10 d,最早收获在第7天,最长14 d。
2.3 核型效果 每例羊水培养可获得1张～2张染色体玻片或培养瓶塑料片,每片可获10个～20个分散较好的分裂相。
3 讨论
3.1 羊水培养首先必须有好的培养基 传统的培养基是在F10中加入一定比例的胎牛血清,由于营养成份较少,羊水细胞培养所需时间较长,培养成功率低。国内有些学者通过添加生长因子或用血清代用品［1］来培养羊水,但步骤繁琐,也容易造成污染。我们采用Amnio Max培养基,因其营养成份较齐全,省去了添加生长因子等步骤,方便省时、收效率高。本实验270例羊水细胞均生长良好,形成的圆形、双圆形细胞较多。一次性培养成功260例,成功率为96.30%,比报道的91.6%［2］及92.08%［3］略高,可能与培养基的改进、孕周的选择以及病例数相对较少有关。
3.2 建立收获标准 要收获较多的分裂相,必须在适当的时机收获。我们于10倍目镜和10倍物镜下观察:以梭长形羊水细胞(AF细胞)为主要类型的生长细胞,形成的细胞克隆覆盖1个或1个以上的完整视野；培养瓶中有2个～3个以上细胞克隆,且每个细胞克隆中存在有20个以上的圆形、双圆形或葡萄状透亮细胞；细胞克隆中央的细胞开始老化,克隆周边细胞生长旺盛。
3.3 改进收获方法 我们根据细胞生长密集程度，采用原位法或改用特殊玻璃长弯吸管吹打收集细胞，两种方法结合使用，提高了实验的成功率。
3.4 血性羊水处理 羊水有严重的血细胞污染时,立即在羊水中加入无菌肝素1滴,尽快离心接种,避免红细胞凝集时把羊水细胞也凝集起来［4］,并采取提早换液及多次换液的方法,同样也可获得成功。本组2例严重的血性羊水,用该方法培养获得成功。
3.5 关于抗生素的应用 由于抗生素在抗菌的同时也抑制了羊水细胞的生长,故主张尽量不用或少用。如怀疑羊水受细菌、霉菌或支原体污染时,应考虑使用，用量一般与组织培养相同。我们曾有2例羊水培养时,细胞生长良好,与一般的培养无异,但换液后发现有污染迹象,羊水细胞的正常结构也遭到破坏,疑为支原体污染，及时添加了抗生素,终于收到满意的分裂相。
文献：
［1］ 丁显平.血清代用品在羊水细胞培养染色体分析中的应用［J］.中华医学遗传学杂志,2002,19(2):1802.
［2］ 冯怀英,朱宝生,孟昱时,等.妊娠中晚期羊水细胞胎儿染色体异常核型分析［J］.优生与遗传杂志,2002,10(2):373.
［3］ 杜维霞,赵耘,傅颖华,等.简便羊水培养方法及染色体遗传病的产前诊断［J］.中国优生与遗传杂志,2004,12(1):404.
［4］ 严仁英.实用优生学［M］.第2版.北京:人民卫生出版社,1998：4595.
