改进dUTP缺口末端标记技术法的操作体会
［关键词］ 缺口末端标记技术；细胞调亡；组织切片
末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(Terminal deoxyribonucleic transferase?mediated dUTP nick end?labeling,TUNEL)是依据凋亡细胞内内源性核酸内切酶被激活而将自身染色体DNA切断成缺口或含180 bp～200 bp的3’OH末端片段这一特点，利用末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)将标有标记物(如地高辛、生物素或荧光素等)的脱氧核苷酸(如 dUTP)转移到3’?OH末端，再进行显色显示凋亡细胞。由于正常细胞或繁殖细胞没有DNA断裂，亦无3’?OH末端，故不被显色。TUNEL法检测细胞凋亡是目前国内外学者所广泛采用的一种先进方法，但不易掌握。我们在经过反复摸索后，成功应用该法检测了多种石蜡组织切片的细胞凋亡。现谈谈在TUNEL法操作过程中需要注意的一些环节。
1 前期处理
为确保离体组织的凋亡检测效果，值得高度重视的是离体组织固定须在组织离体后15 min内进行，否则组织发生自溶就会出现DNA的断裂，影响检测结果。我们在工作中应用10%中性甲醛作为固定剂，其在保持组织细胞结构的完整性、组织渗透性［1］上的效果优良。适宜的固定时间为常温条件下4 h～24 h，根据组织大小做相应调整。切片要求平整，厚度以4 μm～5 μm［2］为宜。尽量避免因刀的缺口造成组织划痕，以免影响组织细胞的形态完整，出现非特异性着色。56 ℃～60 ℃恒温箱里烤片4 h，可保证不脱片，但需谨防高温烤片对组织的破坏，因为在高温干燥条件下可以加速组织切片中的氧化。对于切片的保存，许多大的实验室研究人员习惯将组织蜡块连续切片后长期保存在室温条件下，切片后的组织在室温下长期保存也会加速组织切片的氧化，所以在实际工作中可以采用蜡封切片来避免氧化损失以便长期保存。脱蜡务必干净，当室温低于25 ℃时，笔者把二甲苯置入37 ℃温箱内，每缸10 min，以保证脱蜡彻底，否则可能导致染色结果的异常。
2 冲洗
TUNEL技术中常用的缓冲液是磷酸盐缓冲液(PBS)。一般认为，缓冲液的离子浓度和pH值对最终结果均有影响，故PBS的浓度应以0.01 mol/L,pH值7.2～7.4为宜。每次清洗均应注意时间，避免PBS冲洗不充分引起的背景着色。
3 非特异性染色
内源性过氧化物酶是引起非特异性染色的重要原因，如果不进行处理，组织中的红细胞、粒细胞可以干扰染色结果的判断。一般采用比较缓和的方法：3%过氧化氢封闭消除内源性过氧化物酶的活性，对染色结果没有影响。笔者在预实验过程中对3%过氧化氢作用时间分别设置0 min、5 min、10 min三组进行比较，发现作用10 min的组织切片背景非特异性着色明显少于作用5 min及0 min的切片，检测效果最佳。
4 蛋白酶K的消化时间组织
经甲醛固定后，可产生广泛的蛋白质交联，蛋白酶K的作用在于能够暴露因组织固定而导致的抗原决定簇的封闭，以增强染色效果。有实验表明：不同浓度蛋白酶K及其不同消化时间对于暴露DNA断端有影响，并可产生不同的检测结果［3］。笔者用蛋白酶K(20 μg/ml，溶于pH 7.4～8.0的0.01 mol/L Tris?HCl中)37 ℃，不同消化时间进行分组比较，结果发现消化30 min的组织切片阳性细胞数多于消化20 min及10 min的切片，且阳性细胞与阴性细胞色彩对比分明、背景清晰。这可能是因为消化时间延长，导致细胞膜上更多通道形成，利于TdT酶的渗透所致，同时还要注意蛋白酶K应现用现配，以增强消化效果。
5 TUNEL反应液
TUNEL技术的关键是TUNEL反应液需要新鲜配制，在临用前从低温冰箱取出混合均匀，放至冰浴中备用。笔者发现配制好的TUNEL反应液4 ℃放置2 d，-20 ℃放置1周仍可以保证正常使用，但超过上述时间检测效果就差了许多，甚至出现完全的假阴性结果，故新鲜配制非常重要。加入反应液后切片需放入37 ℃恒温箱中1 h并要保持切片湿润，避免干涸，以保证反应充分，否则实验结果不佳，整个过程还应注意避光。
6 POD转换液
使用荧光素标记的辣根过氧化物酶检测系统时，为了保证POD转换液渗透均匀及其反应过程避免干涸，需注意转换液使用剂量和作用时间的控制，以免影响显色效果，笔者使用50 μl作用30 min，效果良好。
7 显色笔者
采用AEC或者DAB显色。显色液一定要注意现用现配，配制好的溶液避光存放，30 min内有效，AEC染色结果为红色，DAB为棕黄色。相比之下，AEC因为色彩绚丽，对比清晰而更利于显微照相。显色一定要在显微镜下控制深浅，以阳性对照片内的显色情况为，其出现稍浓于目的色的时间就是该片的显色时间。由于不同组织、室温、水质等条件都对显色有较大影响，所以不能绝对固定时间，8 min～20 min比较合适。如室温较高，时间应缩短；室温较低，应适当延长，但也不可超过20 min，否则背景易着色。
8 复染
对于细胞凋亡的程度常用细胞凋亡指数这一指标来评估［4］，为此苏木素复染是十分必要的，否则阴性细胞核不易被观察到。苏木素染色时间30 s～20 min，要根据实际情况和需要严格镜下掌握。
9 封片
使用AEC水溶性封片剂进行封片，需防止封片后组织切片内小水泡出现影响到制片质量、组织细胞的观察和显微拍照效果。解决这一问题的办法主要是在封片前将从低温冰箱取出的封片剂置入37 ℃恒温箱中30 min，待之完全融化后再加以使用。切片若要长期保存，可待AEC封片剂完全干燥后，再用中性树胶加盖盖玻片封片，同时也更有利于显微照相。DAB显色后则直接用中性树胶封片。TUNEL技术中严格进行每一步骤的操作非常重要，每一个细节都有可能对最后的结果造成很大的影响，只有仔细认真操作才得到客观满意的结果。
参考：
［1］ Taylor CR.The total test approach to standardization of immunohistochemistry［J］.ArchPathol Lab M ed,2000,124(2):945?951.
［2］ 高思海，潘铁成，杨辰垣.大鼠供心保存期间心肌细胞凋亡的动态变化及褪黑素的保护作用［J］.中华器官移植杂志，2004，25(2)：77?79.
［3］ 郎振为.肝细胞凋亡与病毒性肝炎病理表现［J］.中华肝脏病杂志，1999，7：116?117.
［4］ 王祥卫，杨唐俊，汪泽厚，等.阿霉素诱导人膀胱癌多重抗药性细胞凋亡的研究［J］.第三军医大学学报，1998，20(2)：128.
