诱骗寡核苷酸下调MKN?45细胞OP18 基因表达及对细胞增殖的影响

【摘要】  目的： 探讨转录因子E2F哑铃形诱骗寡核苷酸（Decoy ODNs）对MKN?45细胞中op18基因转录调控的影响及对细胞增殖的抑制作用．方法： 设计合成针对op18启动子上E2F的结合位点序列的哑铃形Decoy ODNs，然后将合成的序列进行退火、连接，使其形成哑铃形的结构，再应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将哑铃形Decoy ODNs转染MKN?45细胞中．TRIzol 法提取细胞总RNA，用RT?PCR方法检测细胞中op18 mRNA表达水平的变化．通过MTT实验监测细胞的生长增殖状况并绘制生长曲线，最后用TUNEL法观察细胞的凋亡的情况．结果： 哑铃形Decoy ODNs被成功转染MKN?45细胞，并成功提取了细胞总RNA. RT?PCR检测发现哑铃形Decoy ODNs转染后的MKN?45细胞中op18 mRNA表达水平明显低于空白对照组，MTT实验所作的生长曲线显示转染细胞增殖速度与空白对照组相比较明显减慢，TUNEL凋亡染色可见凋亡细胞． 结论： 哑铃形Decoy ODNs能特异性抑制E2F转录因子对op18基因的转录调控，进而抑制op18基因表达及MKN?45细胞增殖．

【关键词】  圈套寡核苷酸；转录因子；细胞增殖；基因疗法

　　E2F最初作为腺病毒（adenovirus, Ad）E2启动子的活化因子被发现［1］，它是细胞周期调控过程中起重要作用的转录因子，E2F调控异常存在于多种肿瘤细胞中［2］．靶向E2F转录因子是肿瘤基因的策略之一．目前在治疗多种肿瘤的体内外动物实验中均取得了良好效果，包括非小细胞肺癌、胃癌及乳腺癌等［3-4］. op18（又称oncoprotein18, stathmin）是一种高度保守的细胞内蛋白，该蛋白在恶性肿瘤发生、及决定表型上具有重要作用及意义［5］． Polzin等［6］发现op18基因启动子上有E2F的结合位点，说明op18基因是转录因子E2F调控的靶基因，但截至目前E2F对op18基因的具体调控机制仍未阐明. 本实验应用诱骗寡核苷酸（decoy oligodeoxynucleotides, Decoy ODNs）策略来研究转录因子E2F对op18基因表达及肿瘤细胞的生物学行为影响，初步探讨E2F对op18基因的调控，旨在为肿瘤的生物治疗寻找新的技术方法．

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　MKN?45细胞（人低分化胃癌细胞株）唐都中心实验室保存；TRIzol，LipofectamineTM 2000 (Invitrogen公司）；Taq DNA聚合酶，DGL2000 DNA Marker(北京鼎国生物技术有限公司)；DMEM培养液，1640培养液(GIBCO公司)；T4 DNA连接酶(Promega公司)；所有PCR扩增引物及E2F Decoy序列均由上海英骏生物工程公司合成；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)．

　　1.2方法

　　1.2.1E2F基因Decoy 寡核苷酸设计合成及实验分组

　　根据Polzin等［6］提供的op18基因启动子上E2F的结合位点序列，［7］的方法，合成哑铃形Decoy ODNs，序列如下：EOP1：5′?GGATCCCTTTCCCGCACAGGAAAACCTGTGCGGGAAAG?3′，EOP2：5′?GGATCCTTTGGCGGG AGTTAAAAAACTCCCGCCAAA?3′，EOPm(突变对照）：5′?GGATCC TTTGGCG?
AACGTTAAAAAACGTTCGCCAAA?3′. 斜体部分为op18基因启动子上E2F的结合位点，框内部分为loop，下划线部分为BamHI酶切位点. EOPm的序列是将E2F的结合位点序列进行了突变，作为突变对照．应用梯度退火的方法使合成的序列形成哑铃形的结构．取退火产物4 μL，用T4 DNA连接酶做连接，体系条件按该酶说明书（图1）．根据实验要求分为五组： EOP1组：转染EOP1 Decoy ODNs的MKN?45细胞；EOP2组：转染EOP2 Decoy ODNs的MKN?45细胞；EOP1+EOP2组：转染EOP1和EOP2 Decoy ODNs的MKN?45细胞；EOPm组(突变对照）：转染EOPm Decoy ODNs的MKN?45细胞；

　　1.2.2脂质体介导E2F基因Decoy ODNs的细胞转染

　　转染前1 d，在100 mm平皿中按0.6×105细胞/皿接种MKN?45细胞．脂质体转染操作步骤按LipofectamineTM2000说明书进行．于转染后8 h换为完全DMEM培养液继续培养72 h，分别收集各组的MKN?45细胞进行功能研究．

　　1.2.3RT?PCR检测

　　转染细胞op18基因的表达收集不同组的MKN?45细胞，分别用TRIzol 法提取细胞总RNA．取5 μg总RNA，加入1 μL oligo(dT), 按照逆转录试剂盒操作说明，合成cDNA第1链，以反转录的cDNA为模版，常规PCR扩增op18基因．op18基因引物序列如下，上游引物：5′?TACCGAAGAAGACTATAGGT?3′；下游引物：5′?AATCAGTCGAAGTCAGAGCA?3′，片段大小450 bp．用β?actin基因做为内参照，引物序列如下，上游引物为（68?88）：5′?ATGGATGATGATATCGCCGCG?3′；下游引物（310?330）：5′?TGGTGCCAGATTTTCTCCATG?3′，片段大小263 bp．PCR反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min．各取10 μL扩增产物，1.5  g/L的琼脂糖凝胶电泳0.5 h，凝胶图像分析仪分析结果.

　　1.2.4MTT检测

　　取对数生长期的MKN45细胞，按0.6×105接种100 mm培养板，用阳离子脂质体转染上述细胞，于转染后8 h换为完全DMEM培养液培养48 h，用胰酶消化细胞后，接种于24孔板，每孔细胞数为6×103个，分别于培养后1，3，5和7 d进行MTT实验，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，继续培养4 h，吸除上清后加入DMSO 150 μL/孔，振荡数分钟，使用酶联免疫分析仪490 nm波长处测A值，按下列公式细胞相对抑制率：细胞相对抑制率%=(1-实验孔A值/对照孔A值)×100%．

　　1.2.5TUNEL法检测

　　细胞凋亡将MKN?45细胞接种于铺有盖玻片的100 mm培养皿，分别于第1，3，5，7和9 d收集细胞爬片，40 g/L多聚甲醛固定25 min， 2 g/L Triton X?100处理5 min，加100 μL平衡缓冲液5~10 min, 100 μL TdT酶反应液37℃作用60     min，加100 μL  2×SSC缓冲液终止反应，3 mL/L双氧水5 min，加100  μL Streptaviding?HRP溶液5 min，加100 μL DAB工作液显色并封片．空白对照不加TdT酶，其余步骤同前．

　　2结果

　　2.1Decoy ODNs对细胞中op18基因的表达的影响

　　RTPCR扩增产物电泳结果显示，op18基因的mRNA表达水平在EOP1组降低最显著，EOP1 和EOP2共转染组次之，其次是EOP2组，EOPm组与未转染的MKN?45细胞中op18基因的mRNA表达水平未见下调（图2）．

　　2.2细胞增殖的变化

　　E2F Decoy ODNs处理的MKN?45细胞与空白对照组比较可见生长受到明显抑制．EOP1组在第7 d抑制作用最显著，细胞相对抑制率为65.7%；EOP1 +EOP2组次之，细胞相对抑制率为47.9%；其次是EOP2组，细胞相对抑制率为32.3%；EOPm组与空白对照组结果一致（图3）．
                 
　　2.3肿瘤细胞凋亡检测结果

　　于转染后1，3，5，7及9 d分别收集细胞爬片，TUNEL法染色结果显示：于转染后3 d E2F圈套寡核苷酸处理MKN?45细胞开始出现凋亡，至7 d凋亡达到高峰．各实验组中，EOP1组凋亡最显著，EOP1+EOP2组次之，其次是EOP2组，EOPm组与空白对照组未见明显阳性凋亡细胞（图4）．

　　3讨论

　　op18基因是从淋巴瘤中筛选出的特征性的表达基因，其编码的蛋白为一种高度保守的细胞内蛋白，在细胞周期中可被蛋白激酶磷酸化，阻断op18磷酸化将使细胞分裂停止于G2/M期．细胞内微管相关蛋白磷酸化过程中op18是重要调节因子，直接影响细胞分裂与增殖［5］．Decoy ODNs可以使转录因子的转录活性降低，使其丧失与内源基因作用的能力，导致基因表达受抑制，最终达到基因的目的．根据结构的不同可以分为：未被修饰的寡核苷酸双链，磷酸化的寡核苷酸双链，哑铃形的寡核苷酸等等．未被修饰的寡核苷酸在细胞和血清中易被降解，作用时间短，而磷酸化等修饰过的寡核苷酸将可能会丧失结合的特异性，而且获得免疫原性，使机体对它产生排斥．哑铃形的寡核苷酸，是闭合双链，类似天然DNA，所以增加了对核酸外切酶的稳定性，并且无因被修饰而引起毒副作用［7-8］．本实验中，我们选用了哑铃形Decoy ODNs的结构来抑制转录因子E2F的活性，通过哑铃形的结构能使寡核苷酸作用时间延长和特异性增加，从而有利于观察转录因子E2F对下游靶基因op18的转录调控的情况和细胞增殖的影响．

　　通过本实验，我们初步验证了E2F Decoy ODNs可以特异性抑制E2F的活性，从而使得其下游调控的op18基因表达下调．细胞生长曲线及凋亡染色显示，转染了E2F Decoy ODNs的肿瘤细胞增殖明显受到抑制，说明通过调控E2F的转录活性下调op18基因表达，进而抑制肿瘤细胞的生长并促进细胞凋亡．尽管目前E2F转录因子与肿瘤发生机制的确切关系还不十分清楚，但可以肯定的是，E2F转录因子对细胞周期调控起着重要作用．肿瘤细胞恶性表型多与控制细胞增殖及凋亡的信号中某一环节的失调密切相关，E2F转录因子活性的改变参与了上述过程．虽然各种与E2F转录因子相关的肿瘤基因治疗有着很大的临床应用和开发潜力，但是转录因子E2F在正常细胞生命周期中也发挥重要作用，所以，针对E2F活性的基因治疗手段有可能对正常组织产生副作用，E2F作为生物治疗靶点应用于肿瘤基因治疗仍需要进一步的理论和实验研究．

【】
  　　［1］Kovesdi I, Reichel R, Nevins JR, et al. Identification of a cellular transcription factor involved in E1A trans?activation［J］．Cell, 1986,45:219-228．

　　［2］Nevins JR．The Rb/ E2F pathway and cancer［J］．Hum Mol Genet，2001，10(7)：699-703．

　　［3］Crowe DL, Nguyen DC. Rb and E2F?1 regulate telomerase activity in human cancer cells［J］. Biochem Biophys Acta, 2001,1518 (122):1-6.

　　［4］Kuhn H, Liebers U, Gessner C, et al. Adenovirus?mediated E2F?1 gene transfer in nonsmall?cell lung cancer induces cell growth arrestand apoptosis［J］. Eur Respir J, 2002,20 (3):703-709.

　　［5］吴冰，张立潮，张惠中． Stathmin蛋白的研究进展［J］．肿瘤生物治疗杂志，2005,12(1):71-73.

　　［6］Polzin RG, Benlhabib H, Trepel J, et al. E2F sites in the Op18 promoter are required for high level of expression in the human prostate carcinoma cell line PC?3?M［J］. Gene,2004,341:209-218.

　　［7］Ahn JD, Morishita R, Kaneda Y. Novel E2F decoy oligodeoxynucleotides inhibit in vitro vascular smooth muscle cell proliferation and in vivo neointimal hyperplasia［J］. Gene Ther, 2002,9(24):1682-1692.

　　［8］Lim CS, Jabrane?Ferrat N, Fontes JD, et al. Sequence?independent inhibition of RNA transcription by DNA dumbbells and other decoys［J］. Nucleic Acids Res, 1997,25(3):575-581．